梁嘉斌，郭嘉明，郭堯平，陳糾，劉移民

1.廣州市第十二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510620

2.廣州市職業(yè)病防治院，廣東 廣州 510620

砷是地殼的天然成分，廣泛分布于空氣、水和陸地的環(huán)境中。砷的無機(jī)形態(tài)是劇毒的，其中亞砷酸鹽［As（Ⅲ）］毒性最大，五價(jià)的砷酸鹽［As（Ⅴ）］毒性較大，而有機(jī)砷毒性較小甚至無毒。人們可通過飲用受污染的水，食用受污染的食品以及職業(yè)接觸等途徑接觸到高水平的砷。長(zhǎng)期接觸或攝入砷及其化合物，可導(dǎo)致慢性砷中毒，皮膚損傷和皮膚癌是最典型的影響。準(zhǔn)確測(cè)定砷接觸人群的體內(nèi)砷負(fù)荷是進(jìn)行早期防治的關(guān)鍵。我國(guó)現(xiàn)行有效的檢測(cè)尿中砷的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為WS/T 474—2015 《尿中砷的測(cè)定 氫化物發(fā)生原子熒光法》，該標(biāo)準(zhǔn)推薦的樣品前處理方式為“加入混合酸，置電熱板上，在較低溫度下加熱消化至冒白煙、溶液無色透明為止，不得蒸干”，然而該標(biāo)準(zhǔn)并未明確消化的溫度和電熱板的性能。由于不同品牌和型號(hào)的電熱板最高額定溫度不同，因此可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室的尿砷前處理方式存在較大差異。此外，很多實(shí)驗(yàn)室反映使用該方法的檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)低于電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）的測(cè)定值。因此本研究擬比較不同溫度對(duì)消化結(jié)果的差異，使用有機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析造成這種差異的原因，并以此為基礎(chǔ)，建立優(yōu)化尿中砷測(cè)定的原子熒光法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

AFS-9800 原子熒光光度計(jì)（北京海光儀器有限公司），NEXION 350X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，美國(guó)PerkinElmer 公司），砷空心陰極燈（北京有色金屬研究總院），HT-300 實(shí)驗(yàn)電熱板（工作溫度：室溫～400℃，中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 主要試劑

硼氫化鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；氫氧化鈉，廣州化學(xué)試劑廠，分析純；鹽酸、硝酸、硫酸，廣州化學(xué)試劑廠，優(yōu)級(jí)純；高氯酸，上海桃浦化工廠，優(yōu)級(jí)純；硫脲，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；抗壞血酸，廣州化學(xué)試劑廠，分析純；砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，GSBG62028-90（3302），國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院，1 000 mg·L-1；砷甜菜堿，GBW08670，0.518 μmoL·g-1，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；砷膽堿，GBW08671，0.374 μmoL·g-1，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；亞砷酸根，GBW08666，1.011 μmoL·g-1，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；砷酸根，GBW08667，0.233 μmoL·g-1，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；內(nèi)標(biāo)混標(biāo)（6Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi：10 mg·L-1），美國(guó)PERKINELMER。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器主要參數(shù)原子熒光光度計(jì)：光電倍增管負(fù)高壓270 V，燈電流60 mA，原子化器高度8 mm，屏蔽氣流速800 mL·min-1，載氣流速400 mL·min-1，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)量，峰面積讀數(shù)，延遲時(shí)間1 s，讀數(shù)時(shí)間10 s，進(jìn)樣體積1.00 mL。ICP-MS：高頻發(fā)射功率1 300 W，等離子氣體（Ar）流速15 L·min-1，輔助氣（Ar）流速1.2 L·min-1，霧化氣流速0.90 L·min-1，真空度1.3×10-7kPa，鎳采樣錐孔徑1.1 mm，鎳截取錐孔徑0.9 mm，跳峰測(cè)量方式，動(dòng)態(tài)反應(yīng)池模式（dynamic reaction cell，DRC），反應(yīng)氣（O2）流速0.6 L·min-1，RPq 為0.45，測(cè)量點(diǎn)/峰（measuring point）為1，掃描40次，停留時(shí)間50 ms·次-1，重復(fù)3次。

1.3.2 試劑配制混合酸的配制：分別取硝酸、硫酸和高氯酸按3∶1∶1體積混合。硫脲抗壞血酸的配制：稱取12.5 g硫脲，溶于約80 mL純水中，加熱溶解，冷卻后，加入12.5 g抗壞血酸，溶解后，加純水至100 mL。無機(jī)砷加標(biāo)樣品的制備：使用正常人混合尿與亞砷酸根［As（Ⅲ），1.011 μmoL·g-1，75.7 mg·L-1以砷計(jì)］和砷酸根［As（Ⅴ），0.233 μmoL·g-1，17.5 mg·L-1以砷計(jì)］分別制備質(zhì)量濃度（下稱濃度）為151 和175 μg·L-1無機(jī)砷加標(biāo)樣品。有機(jī)砷加標(biāo)樣品的制備：使用正常人混合尿與砷甜菜堿（0.518 μmoL·g-1，38.8 mg·L-1以砷計(jì)）和砷膽堿（0.374 μmoL·g-1，28.0 mg·L-1以砷計(jì)）分別制備濃度為388.5 和288.0 μg·L-1有機(jī)砷加標(biāo)樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：使用砷標(biāo)準(zhǔn)溶液［GSBG62028-90（3302）］和正常人混合尿配制0、5、10、20、30、40 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3.3 前處理方法標(biāo)準(zhǔn)方法—150℃濕式消解：取5 mL 樣品置于錐形燒瓶中，加入15 mL 混合酸，置電熱板上，在150℃下（電熱板指示溫度，下同）加熱消化。冷卻后，用純水定量轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 硫脲抗壞血酸溶液，加純水至刻度，混勻，供測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)方法—220℃濕式消解：取5 mL 樣品置于錐形燒瓶中，加入15 mL 混合酸，置電熱板上，在220℃下加熱消化至高氯酸白煙散盡。冷卻后，用純水定量轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 硫脲抗壞血酸溶液，加純水至刻度，混勻，供測(cè)定。

梯度升溫濕式消解法：取5 mL 樣品置于錐形燒瓶中，加15 mL 混合酸，搖勻后放置過夜，然后置于電熱板上加熱消解。加熱消解溫度梯度為150℃消解1 h，220℃消解1 h，320℃消解30 min，消解趕酸至白煙散盡。冷卻后，用純水定量轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 硫脲抗壞血酸溶液，加純水至刻度，混勻，供測(cè)定。

ICP-MS 法前處理：移取1 mL 樣品至10 mL 容量瓶中，以0.5%硝酸溶液稀釋定容至刻度，搖勻后對(duì)稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.4 梯度升溫濕式消解法的性能指標(biāo)驗(yàn)證按GBZ/T 210.5—2008《職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南 第5部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)測(cè)定方法》對(duì)該方法的線性、檢出限、定量下限、精密度、準(zhǔn)確度和抗干擾能力等性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 不同消解和檢測(cè)方法處理尿液測(cè)定結(jié)果的比較

分別運(yùn)用150、220℃和梯度升溫濕式消解-原子熒光光譜法和ICP-MS 測(cè)定高砷正常人、服用砷劑的白血病病人、砒霜中毒病人尿中總砷含量，結(jié)果見表1。采用ICP-MS 測(cè)定上述樣品中總砷含量均值分別為82.68、130.35、236.15 μg·L-1，梯度升溫到320℃的濕式消解熒光光譜法測(cè)定結(jié)果與ICP-MS 法接近，回收率為97.92%～101.16%，而150℃和220℃濕式消解原子熒光光譜法測(cè)定的結(jié)果回收率均低于90%。

表1 不同消解和檢測(cè)方法處理尿液后總測(cè)定砷結(jié)果的比較（n=3）Table 1 Comparison of urinary arsenic determination results by different digestion and detection methods (n=3)

2.2 不同消解和檢測(cè)方法處理無機(jī)砷和有機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果的比較

從表2可以看出，ICP-MS 的測(cè)定結(jié)果接近配制濃度，回收率在94.57%～105.26%之間，可見此方法測(cè)定準(zhǔn)確。當(dāng)幾種砷化合物經(jīng)過不同溫度的濕式消解后，應(yīng)用原子熒光光譜法測(cè)定砷含量，回收率差異極大。其中經(jīng)過150℃和220℃的濕式消解，砷甜菜堿和砷膽堿幾乎無法測(cè)出，回收率極低；梯度升溫到320℃的濕式消解熒光光譜法測(cè)定砷甜菜堿和砷膽堿的回收率分別為97.59%和99.96%；無機(jī)砷（亞砷酸和砷酸）經(jīng)過不同溫度的濕式消解后對(duì)熒光測(cè)定并沒有顯著影響，測(cè)定回收率均大于90%。

2.3 梯度升溫濕式消解方法的性能指標(biāo)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍和檢出限本方法測(cè)定尿砷濃度在5～40 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為?=91.5X+54.0，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。連續(xù)測(cè)定11次試劑空白，以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限為0.06 μg·L-1，以10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算定量下限為0.18 μg·L-1。連續(xù)測(cè)定11 次總砷含量為0.20 μg·L-1的加標(biāo)尿液，回收率為112%，精密度為9.4%。

2.3.2 精密度和準(zhǔn)確度取空白試管18支，分為3組，每組6 支，每組分別加入砷甜菜堿（mg·L-1以砷計(jì)）0.025、0.075和0.150 mL，亞砷酸根［As（Ⅲ），75.7 mg·L-1以砷計(jì)］0.010、0.030 和0.060 mL，砷酸根［As（Ⅴ），17.5 mg·L-1以砷計(jì)］0.050、0.150 和0.300 mL，隨后以正常人混合尿定容至50 mL，配制成總砷濃度分別為52、156 和312 μg·L-1的低、中、高濃度組尿液樣品，按照“1.3.3”的梯度升溫消解方法進(jìn)行前處理，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表2 不同消解和檢測(cè)方法對(duì)無機(jī)砷和有機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果的比較（n=3）Table 2 Comparison of determination results of inorganic arsenic and organic arsenic standards by different digestion and detection methods (n=3)

表3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Accuracy and precision test results

2.3.3 抗干擾試驗(yàn)在總砷濃度為52、156和312 μg·L-1的加標(biāo)樣品中，分別加入200 倍于砷水平（60 mg·L-1）的金屬離子，包括鉛、鋅、鎘、銅、硒、汞、銻、鐵、鋁和錳，分別進(jìn)行測(cè)定。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，上述濃度的干擾物對(duì)尿砷測(cè)定造成的偏差均小于±10%，表明上述金屬離子不影響本法對(duì)尿中砷的測(cè)定。

3 討論

WS/T 474—2015《尿中砷的測(cè)定-氫化物發(fā)生原子熒光法》第3.4 條對(duì)前處理設(shè)備的要求為“電熱板，1 000 W”，第7.1 條前處理的步驟為“取5 mL 尿樣置于錐形燒瓶中，加入15 mL 混合酸，置電熱板上，在較低溫度下加熱消化至冒白煙，溶液無色透明為止，不得蒸干。冷卻后，用純水定量轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加純水至刻度，混勻。取出10 mL 置于另一具塞刻度試管中，加入2.0 mL 硫脲抗壞血酸溶液，混勻，供測(cè)定。若樣品溶液砷含量超過測(cè)定范圍，可用純水稀釋后測(cè)定，計(jì)算時(shí)乘以稀釋倍數(shù)”。該標(biāo)準(zhǔn)并未明確消化的溫度，也未對(duì)電熱板的最高工作溫度提出要求。由于硝酸和高氯酸的沸點(diǎn)較低，220℃的消化溫度已足以使混合酸中的硝酸和高氯酸沸騰而冒白煙。此外，據(jù)調(diào)查，現(xiàn)在市面上常用的電熱板以及石墨消解儀的最高溫度多在220℃以下。然而，由于有機(jī)砷中的砷原子與碳原子間具有結(jié)合力很強(qiáng)的化學(xué)鍵，需要較劇烈的實(shí)驗(yàn)條件才能破壞砷碳鍵的鍵能，有資料表明，在濕法消解處理中需要加熱達(dá)到300℃的條件，才可破壞有機(jī)砷化合物［1］，而本次對(duì)砷甜菜堿和砷膽堿標(biāo)準(zhǔn)品的消化實(shí)驗(yàn)也證明了150℃和220℃的濕式消化無法有效將有機(jī)砷分解為無機(jī)砷。在食品檢測(cè)領(lǐng)域，有多個(gè)研究證明200℃濕式消解和微波消解［1］均難以把有機(jī)砷完全消解為無機(jī)砷。而在ICP-MS 測(cè)定時(shí)，雖不能在前處理時(shí)將尿液中的有機(jī)砷完全消解為無機(jī)砷，但樣品消解液通過可達(dá)10 000 K 高溫的等離子體后，各類砷化合物中的砷元素均轉(zhuǎn)化為砷離子，再通過質(zhì)譜檢測(cè)，由此可以得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

不同人群的尿中含有不同比例的有機(jī)砷，對(duì)健康志愿者的砷形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，食用海鮮組的尿液中檢出砷甜菜堿平均含量是未食用海鮮組的2.38 倍，而且食用海鮮組志愿者尿液中的砷甜菜堿含量遠(yuǎn)高于無機(jī)砷［2］。此外，尿液中的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）含量隨存儲(chǔ)時(shí)間增加而減少，而有機(jī)砷含量隨存儲(chǔ)時(shí)間增加而變大［3］。由此可見有機(jī)砷消化不完全將導(dǎo)致總砷測(cè)定值偏低，這可能是多個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用原子熒光法測(cè)定尿中砷結(jié)果低于ICP-MS 的原因。

《尿中砷的測(cè)定-氫化物發(fā)生原子熒光法》以硝酸-硫酸-高氯酸體系來消化樣品，其中高氯酸是強(qiáng)氧化劑，遇有機(jī)物可發(fā)生劇烈氧化反應(yīng)造成有機(jī)物迅速分解，放熱壓力急劇升高而爆炸，因此本研究使用放置過夜和梯度升溫的方式，除去有機(jī)物和高氯酸，提高實(shí)驗(yàn)安全性。本實(shí)驗(yàn)證明320℃以上的梯度升溫，能把砷甜菜堿和砷膽堿等有機(jī)砷轉(zhuǎn)換為無機(jī)砷。但該方法也存在局限性，主要是耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，并需要專人看護(hù)，需要最高溫度可達(dá)320℃以上的電熱板，如果消化程序不規(guī)范或?qū)嶒?yàn)人員經(jīng)驗(yàn)不足，很可能因生成三氯化砷（沸點(diǎn)130℃）而揮發(fā)損失，也可能因?yàn)檎舾苫蛏郎剡^快、過高導(dǎo)致炭化而損失。為了避免上述問題，消解時(shí)需要進(jìn)行梯度升溫，且升溫速度不可過快，如果消解時(shí)出現(xiàn)炭化的趨勢(shì)（試樣開始變黑）應(yīng)取下放置到室溫后繼續(xù)加混合酸消解，直到樣品清亮透明。