孔令巖 柴儀△ 李倩 常波倫 劉爍煒 暴凱 麻叢叢

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種因骨量低下，骨的纖維結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加，從而引起骨折發(fā)生危險性升高的一種全身性疾病[1]。OP患者既可以沒有任何臨床癥狀，也可以表現(xiàn)為四肢、關(guān)節(jié)、脊柱等全身骨痛，脊柱發(fā)生病變易導(dǎo)致脆性骨折等[2]。因此，OP已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問題之一。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨之功效，臨床上常用于治療腰腿疼，且有利于骨折愈合。淫羊藿的有效成分是淫羊藿總黃酮，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞骨吸收的作用[3]。黃芪具有補(bǔ)氣健脾、托瘡生肌之功效，其化學(xué)成分主要是黃芪多糖，能夠通過拮抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化來控制骨代謝[4]。因此，本研究將淫羊藿總黃酮和黃芪多糖配伍，旨在觀察補(bǔ)腎健脾法對去勢OP大鼠的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

研究所用雄性SD大鼠50只(體質(zhì)量80～110 g)，中位數(shù)95 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心所提供，動物許可證號為SCXK(冀)2018-1-004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

淫羊藿總黃酮(Epmedium Flavonoid，EF)、黃芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS)均為實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法參見文獻(xiàn)[5-6]。Ca試劑盒、P試劑盒、BGP試劑盒(南京建成)。

1.3 方法

1.3.1造模方法 大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，按照(0.4 mL/100 g)劑量注射1%戊巴比妥鈉溶液行腹腔麻醉，手術(shù)操作均在無菌的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行。正常組大鼠切除卵巢周圍等量的脂肪組織，但不切除卵巢，其余操作均與造模組相同。術(shù)后，所有大鼠給予青霉素肌內(nèi)注射，以預(yù)防切口感染，連續(xù)注射3 d。最后將大鼠放入單籠中飼養(yǎng)，并放置烤燈烘烤。

1.3.2分組方法 造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、淫羊藿總黃酮組、黃芪多糖組和淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組(各10只)。

1.3.3干預(yù)方法 淫羊藿總黃酮組給予淫羊藿總黃酮90 mg/(kg·d)，黃芪多糖組給予黃芪多糖600 mg/(kg·d)，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組給予含有淫羊藿總黃酮和黃芪多糖混懸液690 mg/(kg·d)，正常組和模型組給與等體積生理鹽水。連續(xù)給藥12周，每周測大鼠體質(zhì)量。

本次實(shí)驗(yàn)中大鼠的使用和處理均參照美國國家衛(wèi)生研究院制定的《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行，所有的動物實(shí)驗(yàn)程序均通過河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查和批準(zhǔn)。

1.3.4樣本的采集和制備 各組大鼠給以戊巴比妥鈉(0.4 mL/100 g)進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，下腔靜脈插管取血，將血液樣本放置2 h后，3 000 r/min離心20 min，提取血清，儲存于-20 ℃冰箱中。去左側(cè)全段股骨，刮除肌肉組織，蒸餾水沖洗，放入錫紙包裹，標(biāo)記，并放于-80°冰箱保存。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定血Ca、血P和BGP含量。

1.4 指標(biāo)測定

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定血Ca、血P和BGP含量。將股骨標(biāo)本置于三氯甲烷-甲醇混合液中，脫脂72 h，再放入120 ℃烤箱，烘烤60 min，稱重。將稱重后的標(biāo)本放于800 ℃馬弗爐，12 h后呈白色灰狀，稱重，并溶解于HNO3∶H2O中，測定骨Ca及骨P的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血Ca、血P和BGP水平

與正常組大鼠相比較，模型組大鼠血Ca、血P和BGP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明卵巢切除導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)一定程度的骨質(zhì)疏松癥狀；與模型組大鼠相比較，各給藥組大鼠血Ca、血P和BGP水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能改善OP大鼠的骨質(zhì)疏松癥狀；對于BGP水平，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果優(yōu)于單藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血Ca、血P和BGP水平

2.2 骨干質(zhì)量、骨灰質(zhì)量、骨Ca及骨P的含量

與正常組大鼠相比較，模型組大鼠骨干質(zhì)量、骨灰質(zhì)量、骨Ca及骨P的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明OP大鼠骨量減少；與模型組大鼠相比較，各給藥組大鼠骨干質(zhì)量、骨灰質(zhì)量、骨Ca及骨P的含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能使OP大鼠的骨量增加；此外，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果優(yōu)于單藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠骨干質(zhì)量、骨灰質(zhì)量、骨Ca及骨P的含量

3 討論

OP是一種由多因素誘發(fā)的骨強(qiáng)度下降、骨微結(jié)構(gòu)被破壞的綜合性代謝性疾病，骨折是其最嚴(yán)重也是最常見的并發(fā)癥[7]。OP與年齡密切相關(guān)，絕經(jīng)期婦女由于雌激素水平下降易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀[8]，表現(xiàn)為骨小梁變小、骨皮質(zhì)變薄及骨密度(BMD)下降等特征[9]。目前臨床上治療OP主要以抑制骨吸收的二磷酸鹽為主，但易出現(xiàn)下頜骨壞死、非典型性骨折等并發(fā)癥[10]。因此，研究防治OP的新藥具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的補(bǔ)腎中藥淫羊藿是小檗科草本莖葉，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛甘性溫，歸肝腎二經(jīng)，是補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨的要藥[11]。有研究表明，淫羊藿主要成分為黃酮類物質(zhì)，而酮類物質(zhì)被證明具有類雌激素樣作用，因此，淫羊藿具有抗OP、調(diào)節(jié)雄性發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗衰老、抑制腫瘤等作用[12]。馮云波等[13]探討淫羊藿總黃酮對OP大鼠的保護(hù)作用，將45只3個月齡大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為三組：正常組(n=15)、模型組(n=15)、淫羊藿總黃酮組(n=15)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮組大鼠骨皮質(zhì)較完整，骨量分布較均勻，骨髓內(nèi)小梁結(jié)構(gòu)較清晰。羅靜華等[14]通過實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為淫羊藿黃酮化合物早期通過促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折端血管重建的速度和數(shù)量，促使成骨細(xì)胞的分化、趨化與成熟和多種修復(fù)性生理因子的聚集，增進(jìn)鈣鹽吸收、沉著，并在骨折塑性期激活破骨細(xì)胞加速骨痂改建，進(jìn)而改善骨痂內(nèi)礦化組織分布和顯微結(jié)構(gòu)的連接性使骨折恢復(fù)原有外形和強(qiáng)度。黃芪首載于東漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有兩千多年的用藥史[15]，具有補(bǔ)氣健脾、托瘡生肌、升陽舉陷、利水消腫等功效。黃芪的主要化學(xué)成分是黃芪多糖，現(xiàn)代研究表明黃芪多糖具有抗OP、抗腫瘤、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等活性，且能改善骨細(xì)胞代謝[4]。張宏波等[16]研究黃芪多糖對去試OP大鼠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成的作用，對OP具有預(yù)防作用。OP與脾、腎兩臟密切相關(guān)，腎主骨生髓，脾為生化之源，若脾腎虧虛，氣血、筋骨失養(yǎng)，易導(dǎo)致OP的發(fā)生。因此，在臨床上依據(jù)OP的發(fā)病機(jī)理，可運(yùn)用補(bǔ)腎健脾的方法作為治療OP的重要原則。有研究表明，補(bǔ)腎健脾中藥能夠明顯改善OP大鼠的骨代謝狀態(tài)，具有抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成的作用[17]。劉振東等[18]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾湯能夠明顯降低OP患者的骨保護(hù)素(OPG)水平，增加胰島素樣生長因子(IGFs)水平，改善患者的臨床癥狀。

本研究結(jié)果顯示，各給藥組大鼠血Ca、血P和BGP水平均明顯升高，提示淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能改善OP大鼠的骨質(zhì)疏松癥狀。BGP的變化可代表骨代謝的變化，因此臨床上將BGP作為骨形成的生化參考指標(biāo)。對于BGP水平，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果優(yōu)于單藥組，表明兩藥配伍可能存現(xiàn)協(xié)同效果。此外，各給藥組大鼠骨干質(zhì)量、骨灰質(zhì)量、骨Ca及骨P的含量均明顯升高，表明淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能使OP大鼠的骨量增加，且淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果更顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對于OP的防治，用補(bǔ)腎壯骨的淫羊藿配伍健脾益氣的黃芪，以達(dá)到健脾補(bǔ)腎的功效，與祖國醫(yī)學(xué)的整體觀念和辨證論治相一致。

綜上所述，淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍對去試OP大鼠均具有一定的治療作用，且配伍組的療效更優(yōu)，不僅能夠提高血Ca、血P和BGP水平，增加骨干質(zhì)量、骨灰質(zhì)量、骨Ca及骨P的含量，降低骨折的風(fēng)險。因此，開展淫羊藿總黃酮配伍黃芪多糖防治OP具有潛在的研究價值，可為補(bǔ)腎健脾法的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。