簡(jiǎn) 丹，劉 誠(chéng),2

（1.江南大學(xué) 理學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.中國(guó)科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所，上海 201800）

引言

生化傳感技術(shù)可以對(duì)特定的生物化學(xué)被測(cè)物進(jìn)行識(shí)別、測(cè)量與分析，是目前生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最為常用的工具。多數(shù)生化傳感技術(shù)都是將被測(cè)樣品的性質(zhì)（如含量、結(jié)構(gòu)等）轉(zhuǎn)化為可以直接測(cè)量的物理量，其覆蓋力學(xué)、熱學(xué)、聲學(xué)、電學(xué)和光學(xué)參量等[1-7]。由于光學(xué)參量測(cè)量具有非接觸、低損傷和易測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)，并且可以通過(guò)測(cè)量包括強(qiáng)度、相位、偏振、光譜[8-10]等多維度信息實(shí)現(xiàn)樣品多參數(shù)檢測(cè)，因此基于光學(xué)參數(shù)測(cè)量的各類生化傳感器獲得了更多的應(yīng)用。其中，包括吸收光譜[11-13]、熒光光譜[14-15]和拉曼光譜[16-17]的各類光譜檢測(cè)技術(shù)是生化傳感中的重要手段。在各類光譜應(yīng)用中，其與酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）的結(jié)合是最為常見(jiàn)的應(yīng)用之一[18-19]。雖然傳統(tǒng)的光譜儀能夠以極高的分辨率實(shí)現(xiàn)對(duì)特定光譜的測(cè)量與分析，但是也存在系統(tǒng)復(fù)雜、價(jià)格昂貴等諸多缺點(diǎn)，導(dǎo)致其只適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并不是現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的首選工具。

小型化光譜儀是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)光譜檢測(cè)的理想工具。商業(yè)化和準(zhǔn)商業(yè)化的小型化光譜儀主要有美國(guó)德州儀器公司設(shè)計(jì)的基于數(shù)字微鏡陣列的光譜儀[20]以及日本濱松光子[21]開(kāi)發(fā)的芯片式光譜儀，但是前者價(jià)格昂貴，而后者難以和現(xiàn)有生化檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合。為了實(shí)現(xiàn)低成本的生化檢測(cè)，美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校OZCAN 研究組提出了基于光纖束的智能手機(jī)ELISA 測(cè)量系統(tǒng)[22]，其不僅成本可控，而且可以直接對(duì)96 孔板中的大量樣品進(jìn)行高通量測(cè)量；但是該系統(tǒng)只能對(duì)特定波長(zhǎng)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量與分析。美國(guó)伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校CUNNINGHAM 研究組[23]，華盛頓州立大學(xué)LI 研究組[24]和賓夕法尼亞州立大學(xué)LIU 研究組[25]分別設(shè)計(jì)了基于光柵的小型化智能手機(jī)光譜儀，可以覆蓋全可見(jiàn)光光譜，并成功對(duì)胎兒纖維蛋白、氧磷、牛血清蛋白等生物樣品進(jìn)行了檢測(cè)。另外，本課題組還設(shè)計(jì)了基于太陽(yáng)光的小型化智能手機(jī)光譜儀[26]，實(shí)現(xiàn)了包括豬圓環(huán)病毒抗體和禽流感病毒抗體的測(cè)量。雖然這些基于智能手機(jī)的小型化光譜儀體積小巧、價(jià)格可控，能夠用于現(xiàn)場(chǎng)光譜檢測(cè)應(yīng)用中，但是也存在檢測(cè)通量低、探測(cè)器性能不穩(wěn)定等缺陷。

為了滿足高通量、高光譜分辨率和價(jià)格可控的現(xiàn)場(chǎng)光譜測(cè)量應(yīng)用需求，本文設(shè)計(jì)了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)，其尺寸緊湊僅為118 mm×94 mm×100 mm，且價(jià)格可控；但是仍舊具有極高的光譜分辨率和測(cè)量精度。另外，該系統(tǒng)設(shè)計(jì)了多通道光譜測(cè)量結(jié)構(gòu)，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品從而有效提高了測(cè)量通量。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品（羅丹明6G）和實(shí)際樣品（禽流感病毒抗體）的測(cè)量證明了本文設(shè)計(jì)的小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)各類目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。因此，本文設(shè)計(jì)的小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)有望成為現(xiàn)場(chǎng)光譜測(cè)量的理想工具。

1 系統(tǒng)構(gòu)建與光譜標(biāo)定

圖1（a）展示了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

圖1 小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)Fig.1 Portable multi-channel spectral measurement system

寬譜光源由白光LED 提供，雖然相較于商業(yè)光譜儀中常用的高壓汞燈，其光譜均勻度并不理想，但是LED 體積小巧，對(duì)電源要求低，更適用于小型化光譜儀的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。另外，在實(shí)際測(cè)量中，用于后期處理和分析的光譜數(shù)據(jù)實(shí)際上是樣品透射光譜和背景光譜的比值，該操作步驟能夠有效補(bǔ)償LED 非均勻光譜的影響。待探測(cè)光透過(guò)比色皿（7.5 mm×7.5 mm×10 mm）后，使用一成像透鏡（直徑10 mm，焦距30 mm，大恒光電，中國(guó)）將其聚焦并使用100 μm 小孔進(jìn)行濾波，最后再使用一成像透鏡（直徑10 mm，焦距30 mm，大恒光電，中國(guó)）將光束匯聚至光柵（1200 線/mm，Thorlabs，美國(guó)）表面用于色散分光。使用兩組透鏡的原因是該設(shè)計(jì)結(jié)合小孔濾波不僅可以提高光譜分辨率，而且較直接透過(guò)小孔或者狹縫的方式，還可以提高光的利用率。

此外，為了實(shí)現(xiàn)高通量光譜測(cè)量，小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)包含了如圖1（a）所示的三路光譜測(cè)量結(jié)構(gòu)，其光譜均由單個(gè)光柵色散后使用同一CCD 圖像傳感器（Allied Vision Pike421B，德國(guó)）接收。考慮到使用的圖像傳感器的靶面大小以及光學(xué)系統(tǒng)的體積，這里僅構(gòu)建了三通道結(jié)構(gòu)；但是如果進(jìn)一步增大探測(cè)器的靶面，并選擇更為緊湊的光譜測(cè)量結(jié)構(gòu)，通道數(shù)還能夠進(jìn)一步提高。裝調(diào)光路和設(shè)計(jì)光路之間存在的誤差可能會(huì)導(dǎo)致光譜成像的畸變，因此在系統(tǒng)裝調(diào)中需要確保光路光軸的一致性。雖然卡槽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以將光學(xué)元件排布成等距陣列并固定，極大的減少了光學(xué)元件間距對(duì)光譜位置分布造成影響，但是在裝配過(guò)程中可能存在裝調(diào)傾斜，依舊會(huì)導(dǎo)致光譜位置分布不均勻，因此在裝調(diào)過(guò)程中需要保證LED 燈珠的入射光角度以及透鏡的中心軸不存在傾斜和偏轉(zhuǎn)。當(dāng)CCD 圖像傳感器上光譜的成像間隔和所設(shè)計(jì)的透鏡中心位置的間距一致時(shí)表明系統(tǒng)裝調(diào)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。使用3D 打印結(jié)構(gòu)將光源、樣品槽、透鏡、小孔、光柵以及CCD 圖像傳感器集成，小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)的尺寸為118 mm3×94 mm3×100 mm3。

另外，為了在終端上直接控制白光LED 和圖像傳感器以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)光譜測(cè)量，本文還為小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)設(shè)計(jì)了軟件，如圖1（b）所示。首先，該軟件通過(guò)串口繼電器實(shí)現(xiàn)白光LED的控制，而CCD 圖像傳感器通過(guò)USB 與單板計(jì)算機(jī)的連接以完成光譜圖像拍攝和傳輸。之后，該軟件通過(guò)抽取多行像素值進(jìn)行平均獲得各個(gè)通道的像素點(diǎn)-光譜強(qiáng)度對(duì)應(yīng)關(guān)系。最后，根據(jù)預(yù)先標(biāo)定的各個(gè)通道的像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系，重建光譜以精確獲得可見(jiàn)光范圍內(nèi)各個(gè)波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度分布。

為了標(biāo)定各個(gè)通道的像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系，將白光LED 換成450 nm、532 nm 和650 nm 的激光器，并提取各通道對(duì)應(yīng)的像素點(diǎn)-光譜強(qiáng)度對(duì)應(yīng)關(guān)系，如圖2（a）所示，其中光譜強(qiáng)度的峰值位置對(duì)應(yīng)了各個(gè)激光波長(zhǎng)。隨后，將激光波長(zhǎng)與其對(duì)應(yīng)的像素位置作直線擬合，即可確定各通道像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系，如圖2（b）所示。擬合直線的R2都極接近1，證明各通道的像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系具有良好的線性。另外，3 個(gè)通道擬合直線的斜率分別為7.54，8.05 和7.34，其倒數(shù)是對(duì)應(yīng)的光譜分辨率，分別為0.133 nm/pixel，0.124 nm/pixel 和0.136 nm/pixel，物理含義是每個(gè)像素點(diǎn)代表的光譜波長(zhǎng)寬度?？梢钥闯? 個(gè)通道都具有極高的光譜分辨率，從而能夠滿足光譜測(cè)量應(yīng)用的需求。根據(jù)各個(gè)通道標(biāo)定的像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系，可將圖2（a）所示的像素點(diǎn)-光譜強(qiáng)度對(duì)應(yīng)關(guān)系重建為激光器的光譜信息，如圖2（c）所示。3 個(gè)通道的激光器光譜分布吻合較好，證明了像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系的準(zhǔn)確標(biāo)定。雖然使用更多不同波長(zhǎng)的激光器用于標(biāo)定，并使其波長(zhǎng)更為全面地覆蓋可見(jiàn)光波段，則擬合獲得的像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系更為準(zhǔn)確；但是過(guò)多的激光也會(huì)導(dǎo)致標(biāo)定過(guò)程更為復(fù)雜。因此，這里僅選擇了3 種不同波長(zhǎng)的激光，且盡可能覆蓋了可見(jiàn)光波段，同時(shí)保證了標(biāo)定的準(zhǔn)確性和便捷性。

在系統(tǒng)構(gòu)建和光譜標(biāo)定的基礎(chǔ)上，將小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)用于代表標(biāo)準(zhǔn)樣品的羅丹明6G 和代表實(shí)際樣品的禽流感病毒抗體的檢測(cè)，以評(píng)估本文提出的小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)在現(xiàn)場(chǎng)光譜測(cè)量應(yīng)用中的可行性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

在對(duì)實(shí)際樣品測(cè)量之前，首先使用小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)對(duì)鹵素?zé)艉桶坠釲ED 光譜進(jìn)行了測(cè)量以評(píng)估其光譜測(cè)量準(zhǔn)確性。首先使用小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)對(duì)鹵素?zé)舻墓庾V進(jìn)行了測(cè)量。圖3（a）中實(shí)線表示各通道對(duì)同一鹵素?zé)舻墓庾V測(cè)量結(jié)果，一致的光譜測(cè)量結(jié)果表明小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)各通道裝調(diào)的均一性。之后，對(duì)系統(tǒng)各通道內(nèi)置白光LED 的光譜進(jìn)行測(cè)量，圖3（b）中的實(shí)線展示了各通道白光LED 的光譜，其光譜形貌較為一致，說(shuō)明了使用的白光LED 質(zhì)量較為均一。為了驗(yàn)證小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)光譜測(cè)量的準(zhǔn)確性，還使用了商業(yè)化的光纖光譜儀（復(fù)享光學(xué)，中國(guó)）對(duì)鹵素?zé)艉桶坠釲ED 的光譜進(jìn)行了測(cè)量，測(cè)量結(jié)果如圖3（a）和（b）虛線所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的光譜測(cè)量結(jié)果與商業(yè)光譜儀吻合較好，證明了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的光譜測(cè)量。

圖3 小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)光譜測(cè)量驗(yàn)證Fig.3 Spectral measurement verification on portable multichannel spectral measurement system

在確定該小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)光譜測(cè)量準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，首先使用該系統(tǒng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了測(cè)量。這里使用已知濃度的羅丹明6G 溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，其濃度分別為2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL 和10 μg/mL。將一系列溶液放置于比色皿中，并使用小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量其光譜以獲得對(duì)應(yīng)的吸收譜線，如圖4（a）所示。值得說(shuō)明的是，在每一次測(cè)量中，各通道的比色皿上均放置同一濃度的羅丹明6G 溶液，因此圖4（a）所示的吸收譜線實(shí)際上是各通道的測(cè)量結(jié)果（不同通道對(duì)應(yīng)不同的線型）。對(duì)于同一濃度的羅丹明6G 溶液，各通道吸收譜線基本一致，而且在520 nm 處的吸收峰明顯與羅丹明6G 濃度有關(guān)。圖4（b）擬合了羅丹明6G 濃度與520 nm 處吸光度（OD520）的關(guān)系：3 條擬合直線的R2分別為0.998，0.996 和0.998，證明羅丹明6G 溶液濃度與OD520 之間滿足線性關(guān)系；此外，3 條擬合直線非常接近，也證明了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)具有很好的測(cè)量準(zhǔn)確性和通道均一性。

圖4 不同濃度羅丹明6G 溶液對(duì)應(yīng)的吸收譜及其濃度與OD520 的直線擬合關(guān)系Fig.4 Absorption spectrum of Rhodamine 6G solutions in different concentrations and linear fitted relation between solutions concentration and OD520

最后使用禽流感H7N9 病毒抗體作為樣品，使用小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗體稀釋度的定量測(cè)量。為了制備禽流感H7N9 抗體，首先在每個(gè)微孔板的反應(yīng)孔中添加蛋白包被液，并使用碳酸鹽緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的牛血清白蛋白封閉液封閉；然后使用0.01 M 的磷酸鹽緩沖液將H7N9 的抗體分別 稀 釋103，5×103，104，5×104，105，3×105，5×105，8×105和106倍以獲得不同濃度的待測(cè)樣品；隨后加入0.1 mL 磷酸鹽緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體（HAb1）；最后加入TMB 底物顯色液并引入50 μL 濃度為2 M 硫酸以終止酶促反應(yīng)。

為了實(shí)現(xiàn)抗體稀釋度的定量測(cè)量，首先需要確定其與OD450 的關(guān)系。圖5（a）和5（b）分別展示了使用小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)和商業(yè)酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）的測(cè)量結(jié)果。圖5（a）中實(shí)線、虛線和點(diǎn)線分別代表各通道測(cè)量得到的結(jié)果：吸收譜較為吻合且與商業(yè)酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果一致，證明了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。在此基礎(chǔ)上，可以從圖5（a）和5（b）中提取抗體稀釋度與OD450 的關(guān)系。圖5（c）展示了由小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)獲得的抗體稀釋度與OD450 的關(guān)系，該系統(tǒng)的測(cè)量范圍為103～3×105：當(dāng)禽流感H7N9病毒抗體稀釋倍率達(dá)到檢測(cè)下限時(shí)，對(duì)應(yīng)的OD450值與去離子水的OD450 值已沒(méi)有明顯區(qū)別；而當(dāng)稀釋倍率達(dá)到檢測(cè)上限時(shí)，其OD450 值已經(jīng)接近1，無(wú)法測(cè)量濃度高于檢測(cè)上限的抗體樣品。圖5（d）展示了商業(yè)酶標(biāo)儀的測(cè)量結(jié)果，該系統(tǒng)的測(cè)量范圍為103～8×105，與小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)相比，其檢測(cè)上限一致，但是下限更低，但是仍舊處于同一數(shù)量級(jí)。此外，圖5（c）和5（d）中插入圖展示了OD450 與稀釋度對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系：小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)各通道R2分別0.970，0.951和0.973，較高的線性度保證了適用范圍內(nèi)樣品稀釋度的準(zhǔn)確測(cè)量。

圖5 小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用Fig.5 Practical application of portable multi-channel spectral measurement system

最后，為了驗(yàn)證小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的通道一致性，圖5（e）展示了當(dāng)樣品稀釋度為103，104和5×104時(shí)各通道測(cè)量獲得的OD450 值，各通道測(cè)量結(jié)果極為相近證明了在不同稀釋度情況下，小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)各通道均能夠穩(wěn)定準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)樣品稀釋度的定量測(cè)量。此外，為了驗(yàn)證小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的測(cè)量準(zhǔn)確性，圖5（f）展示了當(dāng)樣品稀釋度為5×104時(shí)小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)各通道和商業(yè)酶標(biāo)儀測(cè)量獲得的OD450 值，測(cè)量結(jié)果一致證明了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。作為一種通用檢測(cè)平臺(tái)，小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)可以對(duì)各類樣品實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的光譜測(cè)量與分析。

雖然該小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)樣品快速、準(zhǔn)確和多通道檢測(cè)，而且具有光譜分辨率高和系統(tǒng)緊湊等優(yōu)勢(shì)，因此適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用中；但是該系統(tǒng)仍舊存在不足。首先，本工作設(shè)計(jì)的系統(tǒng)支持樣品多通道同時(shí)測(cè)量，然而更多的通道數(shù)量需要更大尺寸的光學(xué)元件和更大靶面的圖像傳感器，不可避免的增加了系統(tǒng)的成本。根據(jù)圖像傳感器靶面以及常用光學(xué)元件尺寸，本文設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)采用三通道設(shè)計(jì)，一方面比單通道系統(tǒng)具有更高的檢測(cè)效率，另外也盡可能降低了系統(tǒng)成本和復(fù)雜性。其次，光學(xué)元件的缺陷和系統(tǒng)裝調(diào)的誤差不可避免會(huì)導(dǎo)致光譜測(cè)量誤差。為了精確確定各通道像素點(diǎn)-波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)關(guān)系，應(yīng)使用已知光譜的定標(biāo)燈對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行定標(biāo)和驗(yàn)證。本工作使用了多種波長(zhǎng)的激光對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了標(biāo)定，其定標(biāo)結(jié)果也足以保證準(zhǔn)確的光譜測(cè)量。最后，雖然本工作已將該小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)化，但是圖像傳感器仍舊需要外接電源，限制了系統(tǒng)的便攜性。因此，在該系統(tǒng)的未來(lái)優(yōu)化中，可以考慮增加內(nèi)置電源，以保證該系統(tǒng)在無(wú)外部供電的情況下依然能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)光譜測(cè)量。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并構(gòu)建了可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)，其不僅具有較高的光譜分辨率，能夠滿足高精度光譜測(cè)量的需求，而且多通道設(shè)計(jì)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)以提高檢測(cè)通量。另外，該系統(tǒng)尺寸僅為118 mm3×94 mm3×100 mm3，便于攜帶，并且具有獨(dú)立的軟件系統(tǒng)，能夠支持現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量。使用羅丹明6G 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)證了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)具有較高的測(cè)量精度，另外使用禽流感病毒H7N9 抗體作為實(shí)際樣品證明了小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)成功應(yīng)用于目標(biāo)物的準(zhǔn)確測(cè)量。由于該小型化多通道光譜測(cè)量系統(tǒng)具有靈敏度好、分辨率高、測(cè)量準(zhǔn)確、操作便捷、體積小巧等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)各類目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量測(cè)量，從而有望用于各類現(xiàn)場(chǎng)快速光譜檢測(cè)應(yīng)用中。