龔 俊

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,重慶 400044）

目前，隨著生存環(huán)境惡化及生活壓力加大，女性卵巢癌、宮頸癌等患者數(shù)量不斷增加，男性也有一些弱精患者，針對這些患者，尤其是早期癌癥患者，治愈后仍有生育需求，保存其生育能力不失為一種好的選擇，細(xì)胞凍存技術(shù)就發(fā)揮了重要作用[1]。細(xì)胞低溫凍存是指將細(xì)胞置于零下超低溫，使其進(jìn)入“休眠”狀態(tài)，從而達(dá)到長期保存細(xì)胞的目的。低溫能大幅降低細(xì)胞的新陳代謝速率，所以在液氮溫度下細(xì)胞可以安全地長久保存，保存年限更是可以長達(dá)數(shù)十年。綜上，超低溫凍存技術(shù)是目前為止細(xì)胞長期保存最可靠且有效的技術(shù)。因此細(xì)胞低溫保存技術(shù)在細(xì)胞移植和基因治療等領(lǐng)域具有較強(qiáng)應(yīng)用前景。

1 細(xì)胞冷凍保存

1.1 細(xì)胞冷凍原理

低溫能抑制細(xì)胞體內(nèi)所有的生化活動(dòng)，從而使生物體內(nèi)的生化反應(yīng)速率降低、延長其生物活性時(shí)間。因此可以利用這一特性長時(shí)間保存生物體。一切由酶介導(dǎo)的生物體內(nèi)新陳代謝過程中的化學(xué)變化，均服從一些共同的生化規(guī)律。瑞典科學(xué)家S.A.Arrhenius通過研究溫度對化學(xué)反應(yīng)速度的影響，得到了關(guān)系式 ：許多酶反應(yīng)速率等試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一關(guān)系式的正確性[2]。將活化能Ea常規(guī)范圍內(nèi)的數(shù)值代入該式，可推出化學(xué)反應(yīng)速率隨溫度的降低而不斷變小，同時(shí)也能推出生物變質(zhì)速率與溫度成反比的關(guān)系[3]。

1.2 低溫?fù)p傷原理

常溫條件下，細(xì)胞內(nèi)、外的溫度和濃度均一致，處于等溫（溫度）等滲(滲透壓)狀態(tài)，而滲透性和質(zhì)膜特性對于大多數(shù)細(xì)胞低溫保存的成功與否起著決定作用[4]。根據(jù)熱傳遞原理，冷卻過程中，細(xì)胞外的溶液先被冷卻到其凝固點(diǎn)以下。對含水量較高的溶液，析出的固相幾乎是純冰，從而使胞外溶液濃度升高。因此，細(xì)胞內(nèi)外就存在著溫度差和濃度差，它們分別是傳熱和傳質(zhì)的驅(qū)動(dòng)力[5]。

對于體積小、表面積卻很大的細(xì)胞而言，細(xì)胞膜的水滲透率很高。細(xì)胞在溫度不夠低且高濃度的溶液中經(jīng)歷的時(shí)間過長，將導(dǎo)致細(xì)胞的損傷以至死亡，這種損傷被稱為“溶液損傷”（“溶質(zhì)損傷”）。此外，胞內(nèi)冰的形成和再結(jié)晶也會(huì)對細(xì)胞膜造成一定程度的損傷或死亡，這種損傷被稱為“胞內(nèi)冰損傷”[6]。

1.3 細(xì)胞冷凍保存方法

機(jī)體的生化活性在低溫環(huán)境下被抑制，從而降低細(xì)胞總體活性并鈍化機(jī)體新陳代謝速率，最終達(dá)到長期儲存生物樣品的目的。但低溫本身對機(jī)體也有損傷，因此在利用低溫凍存細(xì)胞時(shí)，需先了解細(xì)胞在低溫環(huán)境中的理化性質(zhì)，也應(yīng)當(dāng)選擇合適的凍存保護(hù)劑和凍存方式[7]。

1.3.1 慢速冷凍法

目前，傳統(tǒng)的慢速程序化冷凍法正廣泛應(yīng)用于細(xì)胞保存中。其原理是以低濃度的冷凍保護(hù)劑為輔助，在程序化冷凍儀的控制下逐漸降溫，使得冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞充分脫水過程中，進(jìn)入細(xì)胞，從而阻止胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞。目前大多慢速程序化冷凍都沿用1998年Oktay等提出的經(jīng)典方案[8]，或在此經(jīng)典方案的基礎(chǔ)上改進(jìn)。其優(yōu)點(diǎn)為能較好地保存細(xì)胞，復(fù)蘇后不影響細(xì)胞功能。但該方法需要的冷凍儀器昂貴且操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，因此開展難度大。研究人員正在積極尋找更為高效便捷的方式取代它。

1.3.2 玻璃化冷凍法

玻璃化冷凍法又叫快速冷凍法，其原理為溶液的固化，使用的高濃度冷凍保護(hù)劑經(jīng)快速降溫由液態(tài)直接轉(zhuǎn)化為無結(jié)晶的玻璃化狀態(tài)。這種方法能有效減少胞內(nèi)外冰晶的產(chǎn)生，故更適合冷凍結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的組織，如卵巢等[9]。隨著玻璃化冷凍技術(shù)的一步步優(yōu)化，1985年Rall等率先成功運(yùn)用玻璃化冷凍法對小鼠胚胎進(jìn)行了冷凍[10]。此后，其越來越廣泛應(yīng)用于其他哺乳動(dòng)物如馬、山羊、綿羊等。玻璃化冷凍法操作簡單、方便省時(shí)，但是高濃度的冷凍保護(hù)劑無疑對細(xì)胞產(chǎn)生更大的毒性危害。

1.3.3 干燥冷凍法

干燥冷凍法利用冰升華的方式使細(xì)胞內(nèi)的水分快速移除，從而抑制胞內(nèi)生化反應(yīng)。此方法能在4 ℃乃至常溫下長期儲存精子，極大縮減保存成本。冷凍后的精子會(huì)喪失活力，但保留受精能力和自身DNA完整性。卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的發(fā)展使得精卵結(jié)合不再受精子活力的影響，無疑推進(jìn)了干燥冷凍法的發(fā)展。Olaciregui等已將其成功運(yùn)用于動(dòng)物精子的冷凍[11]，但干燥冷凍法對精子超微結(jié)構(gòu)的影響還有待研究。

有研究[12-13]認(rèn)為，慢速程序化冷凍法采用的CPA濃度較低、毒性較小，利于保存細(xì)胞活性；也有研究表明，玻璃化冷凍法使細(xì)胞內(nèi)外的水直接轉(zhuǎn)化為“玻璃化”狀態(tài)，減少冰晶，更有利于保存細(xì)胞形態(tài)[14]。綜上，究竟哪種方法更有利于保存細(xì)胞還存在爭議。不同比較角度可能導(dǎo)致得出的結(jié)論大相徑庭[15]。

2 冷凍保存對細(xì)胞的影響

2.1 低溫保護(hù)劑類型影響

生物組織中包含很多以電解質(zhì)水溶液形式存在的水。水溶液的凍結(jié)對生物體是致命的，所以要事先加入冷凍保護(hù)劑（cryoprotective agent,CPA）。常用的CPA分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑。CPA可以通過降低細(xì)胞滲透性脫水、阻止冰晶形成、延緩凍結(jié)過程、增強(qiáng)樣品低溫耐受性等來減少低溫保存過程中冷凍對生物樣品的損傷[16]。雖然CPA在一定程度上能減少生物樣品在低溫保存中的損傷，但其本身也具有生物毒性，濃度過高的CPA自然而然會(huì)對細(xì)胞造成毒性損傷[17-18]。因此，開發(fā)高效無毒的低溫冷凍保護(hù)劑意義重大。

2.1.1 滲透性低溫保護(hù)劑

滲透性低溫冷凍保護(hù)劑分子量較小，可以通過滲透擴(kuò)散的方式進(jìn)出細(xì)胞，起到調(diào)節(jié)滲透壓并減輕胞內(nèi)冰晶損傷的作用。但此類保護(hù)劑一般都具有毒性，常用的主要有乙二醇、二甲基亞砜、甘油等，其中甘油對于大多數(shù)細(xì)胞滲透性都很低，應(yīng)用較為有限。乙二醇具有較強(qiáng)滲透性且兼具低毒性[19]，而二甲基亞砜玻璃化能力較強(qiáng)但細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)難以徹底清除。因此，目前的冷凍保護(hù)劑多選用乙二醇和二甲基亞砜的混合液，以獲得作用效果最好、毒性最低的冷凍保護(hù)液，使效果增強(qiáng)且毒性降低[20]。

2.1.2 非滲透性低溫保護(hù)劑

非滲透性保護(hù)劑分子量較大，必須采用輔助手段才能進(jìn)出細(xì)胞，具有低毒性，能促進(jìn)細(xì)胞外液形成玻璃化。主要包括蔗糖、海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等，主要與滲透性低溫保護(hù)劑協(xié)同使用。此外，通過添加牛血清白蛋白等一些生物活性物質(zhì)，能夠起到穩(wěn)定細(xì)胞膜、阻止卵母細(xì)胞在冷凍過程中透明帶硬化的作用[21]。

2.1.3 抗凍蛋白低溫保護(hù)劑

鑒于傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑存在明顯的毒性問題，人們嘗試尋找天然物質(zhì)來代替有機(jī)溶劑充當(dāng)保護(hù)劑的角色，抗凍蛋白就是其中的代表?？箖龅鞍装l(fā)現(xiàn)于南極的魚類中，這類魚生活在零下溫度的極地海洋。但是抗凍蛋白作為一種生物來源的外源物，用于人體時(shí)易引起免疫排斥反應(yīng)。加之其分離較難，目前難以廣泛應(yīng)用[22]。

2.2 冷凍解凍速率影響

2.2.1 冷卻速率

冷凍過程中，細(xì)胞受到損傷的主要溫度為0 ℃和-60 ℃[23]。細(xì)胞外液在-5 ℃到-10 ℃之間時(shí)形成冰晶，但細(xì)胞內(nèi)的水還未達(dá)到結(jié)晶程度。這時(shí)如果冷凍速率很高，細(xì)胞內(nèi)的水不能完全滲出，形成冰晶，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受到機(jī)械損傷；如果冷凍速率很低，細(xì)胞中大部分水分滲出，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃縮，細(xì)胞持續(xù)處于高滲狀態(tài)，持續(xù)收縮，使細(xì)胞器和細(xì)胞膜受損。此外，離子平衡在高滲環(huán)境下會(huì)被打破，從而使細(xì)胞在解凍過程中極易超過等滲體積形成腫脹[24]。因此，過高或過低的冷凍速率都可能導(dǎo)致細(xì)胞受到冷凍損傷，只有尋找到合適的冷卻速率才能達(dá)到相對平衡點(diǎn)，從而減輕胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞的損傷。

2.2.2 解凍速率

凍存過程會(huì)對細(xì)胞造成機(jī)械損傷，解凍過程依然避免不了冰晶的形成，造成細(xì)胞損傷。解凍速率的快慢主要通過水浴溫度來調(diào)節(jié)。在解凍細(xì)胞的早期研究中，科學(xué)家采用在37 ℃的水浴中解凍12 s～30 s，或置于5 ℃的水浴中解凍2 min，比較發(fā)現(xiàn)快速解凍優(yōu)于慢速解凍[25]。研究表明低解凍速率會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)再結(jié)晶，且由于進(jìn)入胞內(nèi)的滲透保護(hù)劑移除速率較慢，加劇胞內(nèi)外滲透壓的形成，使水分快速滲入細(xì)胞，最終破壞其質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。因此，解凍過程中細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡點(diǎn)，對找到最佳的解凍速率至關(guān)重要。

3 細(xì)胞冷凍保存的應(yīng)用與存在問題

3.1 卵母細(xì)胞

低溫保存卵母細(xì)胞會(huì)對其造成冰晶損傷、毒性損傷及滲透損傷，這將阻止細(xì)胞解凍后的質(zhì)量提升。凍存成熟卵母細(xì)胞的主要問題是紡錘體對低溫及冷凍保護(hù)劑有很強(qiáng)的敏感性，極易在凍融過程中受到損傷。未成熟卵母細(xì)胞卻能較好地規(guī)避這一問題，其不具備紡錘體結(jié)構(gòu)，避免了因紡錘體結(jié)構(gòu)受到影響而導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)受損等問題的產(chǎn)生。但未成熟卵母細(xì)胞凍融后的體外培養(yǎng)技術(shù)并不成熟，解凍后在體外難發(fā)育為優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞，面臨的受精差等問題還亟待解決[26]。

目前有學(xué)者提出將微流控法添加-去除保護(hù)劑分別與冷凍載體配合使用，選用透明陶瓷和玻璃制作集成一體化芯片冷凍保存豬卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)凍后質(zhì)量得到提高。這或許能為卵母細(xì)胞的低溫保存提供一個(gè)新的思路[27]。

卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)避免了與未來使用相關(guān)的潛在問題，儲存女性生殖潛能可為那些生育能力受到細(xì)胞毒性治療威脅的婦女提供未來受孕的機(jī)會(huì)，因此更普遍地被接受。該技術(shù)的進(jìn)步，特別是玻璃化的臨床應(yīng)用，已經(jīng)顯著地改善了成熟卵母細(xì)胞冷凍保存的效果，這與胚胎冷凍保存的結(jié)果相當(dāng)[28]。當(dāng)玻璃化人卵母細(xì)胞產(chǎn)生有活力的囊胚時(shí)，活產(chǎn)成功與新鮮卵母細(xì)胞相當(dāng)[29]。卵母細(xì)胞質(zhì)主要通過縫隙連接和顆粒細(xì)胞進(jìn)行胞間交流從而加速胞質(zhì)成熟[30]，這一渠道極其脆弱，在凍融過程中很容易遭到破壞。所以在凍存以前，應(yīng)當(dāng)先采用IVM技術(shù)對未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，直至其成熟。雖然此種凍存方法已有多篇報(bào)道，但成功案例較少[31]，亟待進(jìn)一步優(yōu)化。

宿主的客觀因素(年齡、供卵者和非供卵者卵母細(xì)胞質(zhì)量等)、冷凍方法的選擇、冷凍設(shè)備的質(zhì)量等都可以影響卵母細(xì)胞冷凍保存成功率[32]。加強(qiáng)對卵母細(xì)胞的凍存技術(shù)研究，有助于幫助因患卵巢早衰等生育疾病的婦女解決生育問題，對家庭及社會(huì)具有重要的研究意義。

3.2 精子細(xì)胞

精子目前為止是最常見的干燥細(xì)胞類型，主要來自小鼠和公牛。已經(jīng)應(yīng)用了多種干燥方法，其中冷凍干燥占主導(dǎo)地位。迄今為止，小鼠精子、大鼠精子、倉鼠精子、兔精子及馬精子均已產(chǎn)生后代。超低溫保存的發(fā)展沒有超出大多數(shù)水生物種的探索性研究的地位，缺乏廣泛的應(yīng)用。對于大多數(shù)水生物種來說，除了精子或體細(xì)胞之外，生物材料并沒有被全面地儲存起來，以代表和保存每個(gè)物種的廣泛的遺傳多樣性[33]。干燥的細(xì)胞在復(fù)水后大多不能恢復(fù)生物活性[34]。凍存人類精子的方法比較多，但常規(guī)方法均不利于精子量較少的樣本保存，精液標(biāo)本在冷凍之前需加入冷凍保護(hù)劑，稀釋后精子密度急劇下降，加大凍融后尋找到合適的精子難度[35]。解凍后，精子標(biāo)本需要經(jīng)過洗滌處理去除冷凍保護(hù)劑，這將進(jìn)一步丟失更多的精子。但當(dāng)以空卵透明帶為精子凍貯載體，再把精子顯微注射入其內(nèi)能較好凍存較少數(shù)量的精子[36]。另外，有研究表明，MQ秸稈與GEYC聯(lián)合作為低溫保護(hù)劑有利于低計(jì)數(shù)精液的低溫保存[37]。也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明冷凍前的梯度準(zhǔn)備在冷凍前和融化后均能產(chǎn)生具有更好的活力的冷凍活體，更有利于精子的冷凍保存[38]。此外，未成熟精子體外培養(yǎng)技術(shù)及精原干細(xì)胞移植技術(shù)尚未成熟，因此臨床實(shí)踐中未廣泛開展。

3.3 組織、胚胎和幼蟲

胚胎冷凍保存有可能成為保護(hù)瀕危動(dòng)物品種的有價(jià)值的工具[39]。由于過度捕撈，可食用的紅海膽、白鰭豚的自然種群正在減少。該物種的胚胎和幼蟲對于監(jiān)測海洋污染非常有用，因此有必要保護(hù)胚胎和幼蟲，以促進(jìn)其在水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的不同領(lǐng)域的使用[40]。癌癥或其他疾病的化療和放射治療可導(dǎo)致永久性不孕。雖然青春期和成年男性在治療之前可以選擇冷凍保存精子，但對于尚未產(chǎn)生精子的青春期前男孩來說，這并不是一個(gè)可以實(shí)施的選擇，人睪丸組織低溫保存技術(shù)的研究就很有必要[41]。目前有關(guān)研究都已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但凍后存活率和解凍后活性依然不盡如人意，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低溫保存雖已取得了明顯的效益，但仍是遠(yuǎn)未了結(jié)的課題。近年來，人們對低溫保存的興趣和研究成果急劇增加。目前能實(shí)現(xiàn)低溫保存的生物體，大多數(shù)是簡單的細(xì)胞，所謂組織保存，也是保存其中最主要的細(xì)胞。對干細(xì)胞的低溫保存也并非輕而易舉?？傊€需更進(jìn)一步地研究低溫?fù)p傷機(jī)理，研發(fā)新的技術(shù)，探索新的保存程序，從而實(shí)現(xiàn)對更復(fù)雜的細(xì)胞、組織和器官實(shí)現(xiàn)低溫保存。