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        齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物合成及對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549作用研究

        2021-04-12 06:49:04吳翔宇羅麗梅郭牡丹鄭一敏
        關(guān)鍵詞:齊墩果酸氟尿嘧啶

        吳翔宇,羅麗梅,丁 銳,郭牡丹,鄭一敏

        (1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400054;2.重慶化工職業(yè)學(xué)院,重慶 401220)

        非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)屬于肺癌的一種,其病例數(shù)占肺癌總病例數(shù)的85%以上[1]。常年來(lái),非小細(xì)胞肺癌有著高病發(fā)率與致死率[2-5],且藥物的療效都不盡如人意,患者迫切需要更為安全有效的治療藥物提高生存率。

        齊墩果酸(oleanolic acid,OA)為一種五環(huán)三萜類化合物[6],它存在于青葉膽、女貞子、批把葉等傳 統(tǒng) 中 藥 中,具 有 抗 病 毒[7-8]、抗 炎[9]、保肝[10]、降糖[11-12]、降血脂[13]、抗骨質(zhì)疏松[14]等作用。夏榮木等[15]介紹了OA抗腫瘤作用,但活性欠佳。孟艷秋等[16]以齊墩果酸為原料,對(duì)C-3位羥基、C-12位雙鍵、C-28位羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成出一系列新型齊墩果酸衍生物,對(duì)A549表現(xiàn)出極強(qiáng)的活性,高于陽(yáng)性藥物吉非替尼,但細(xì)胞毒性大。

        為提高齊墩果酸抗肺癌有效性和安全性,本研究對(duì)合成的齊墩果酸氮雜環(huán)新衍生物及其抗非小細(xì)胞肺癌A549的作用進(jìn)行了研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器

        85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);JA1003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);SHB-III循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司);核磁(NMR)-600 MHz(瑞士Bruker);Finnigan-LCQDECA(ESI-MS)(美國(guó)熱電公司);3111型恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛公司);Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛公司);XDS-4B型倒置生物顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司);SW-CJ-1F節(jié)凈工作臺(tái)(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司);800離心機(jī)(常州國(guó)華電器有限公司);FACSVantage SE流式細(xì)胞分析儀(上海碧迪醫(yī)療器械有限公司)。

        1.2 材料

        (3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇購(gòu)于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司;齊墩果酸,氯鉻酸吡啶嗡鹽(PCC),氰基硼氫化鈉(NaBH3CN),N’N-羰基二咪唑(CDI),4-二甲氨基吡啶(DMAP)皆購(gòu)于Adamas公司;乙酸銨(H3CCOONH4),乙酸乙酯(分析純)(EA),石油醚(分析純)(PE),甲醇(分析純)(MeOH),四氫呋喃(分析純)(THF),二氯甲烷(分析純)(DCM),高錳酸鉀(KMnO4,),無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4),碘皆購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠;RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM(高糖)培養(yǎng)基,胰酶,胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天。

        1.3 方法

        1.3.1 齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物的合成

        以齊墩果酸(1)為原料,通過(guò)氧化、還原胺化、縮合反應(yīng)制備齊墩果酸氮雜環(huán)新衍生物(圖1)。

        圖1 齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物的合成路線示意圖

        1)3-氧代-12-烯-28-齊墩果酸(2)的合成

        氬氣保護(hù)下,在250 mL三頸瓶中將1(13.701 g,30 mmol)溶于100 mL無(wú)水THF,接著以3 mL/min的速度滴加60 mL PCC(12.934 g,60 mmol)的無(wú)水THF溶液,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h,薄層色譜(TLC)監(jiān)控[V(DCM)∶V(EA)=50∶1為展開劑]。減壓旋除THF,得到黑色固體,并以20 mL EA溶解后進(jìn)行抽濾,再用80 mL EA沖洗硅膠。收集濾液,以水(120 mL×3)萃取,合并有機(jī)相,以無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓濃縮,濃縮液通過(guò)硅膠層析柱(V(DCM)∶V(EA)=70∶1為洗脫劑)分離純化。得到10.634 g白色固體粉末2,-18℃密封保存。收率:78.0%。

        2)3-氨基-12-烯-28-齊墩果酸(3)的合成

        氬氣保護(hù)下,在100 mL雙頸瓶中將2(0.908 g,2 mmol)溶于40 mL無(wú)水MeOH,加熱至50℃攪拌溶解后,停止加熱,冷至室溫。加入乙酸銨(1.542 g,20 mmol),室溫?cái)嚢?0~120 min,接著以3 mL/min的速度滴加20 mL氰基硼氫化鈉(0.129 g,2 mmol)的無(wú)水MeOH溶液,室溫?cái)嚢?4 h,TLC監(jiān)控[V(DCM)∶V(MeOH)=20∶1為展開劑]。減壓濃縮反應(yīng)液,加入稀NaOH水溶液,調(diào)pH值至8,以DCM(50 mL×3)萃取,合并有機(jī)相,無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓濃縮,濃縮液通過(guò)硅膠層析柱[V(DCM)∶V(MeOH)=40∶1為洗脫劑]分離純化。得到0.648 g黃色固體粉末3,-18℃密封保存。收率:71.2%。

        3)(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲酸(5)的合成

        在250 mL的三頸瓶中將4(3.000 g,20 mmol)溶于60 mL水,再以3 mL/min的速度滴加60 mL高錳酸鉀(4.822 g,30 mmol)水溶液,室溫?cái)嚢?4 h,TLC監(jiān)控[V(DCM)∶V(MeOH)=20∶1為展開劑]。反應(yīng)液以稀鹽酸(6 mol/L)調(diào)pH至2,再以EA(100 mL×3)萃取,合并有機(jī)相,無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓濃縮,濃縮液通過(guò)硅膠層析柱(V(DCM)∶V(MeOH)=30∶1為洗脫劑)分離純化。得到2.872 g淡紅色固體粉末5,-18℃密封保存。收率:87.7%。

        4)齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物(6)的合成

        氬氣保護(hù)下,在50 mL雙頸瓶中將5(0.340 g,2 mmol)溶于25 mL無(wú)水DCM,加入CDI(0.332 g,2 mmol),室溫?cái)嚢?0 min。再依次加入3(0.463 g,1 mmol)和DMAP(0.244 g,2 mmol),室溫?cái)嚢?4 h,TLC監(jiān)控(V(DCM)∶V(MeOH)=50∶1為展開劑)。反應(yīng)液以水(50 mL×3)萃取,合并有機(jī)相,無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓濃縮,濃縮液通過(guò)硅膠層析柱[V(DCM)∶V(MeOH)=80∶1為洗脫劑]分離純化。得到0.437 g白色固體粉末6,-18℃密封保存。收率:71.3%;

        1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ8.03(d,J=10.1 Hz,1H),5.31(s,1H),3.81(td,J=10.3,5.6 Hz,1H),2.93(s,3H),2.85(dd,J=13.6,3.6 Hz,1H),2.55(d,J=22.3 Hz,6H),2.01(dd,J=13.4,10.2 Hz,1H),1.96~1.87(m,2H),1.84~1.71(m,2H),1.72~1.56(m,8H),1.52(t,J=12.7 Hz,1H),1.39(ddd,J=34.5,28.1,12.5 Hz,3H),1.30~1.02(m,8H),1.01~0.90(m,15H),0.80(s,3H);13CNMR(151 MHz,CDCl3)δ183.60,164.48,153.83,151.36,147.47,143.70,139.24,122.52,56.60,56.06,47.64,46.59,45.93,41.66,41.01,39.28,38.97,37.96,37.04,33.86,33.08,32.62,32.47,30.68,28.68,27.70,25.91,25.42,23.61,23.40,23.00,22.86,21.90,21.56,18.63,17.15,16.61,15.31;ES-MSof[C38H57N3O3]+:theoretical m/z of[M+H]+=605.44,measured m/z of[M+H]+=604.90;ES-MSof[C38H57N3O3]-:theoretical m/z of[M+H]-=603.44,measured m/z of[M+H]-=602.84。確證該齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物為3-N-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲?;?齊墩果酸,命名為QDGS-6。

        黨的十八大以來(lái),中國(guó)鐵路昆明局集團(tuán)主動(dòng)適應(yīng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展新常態(tài),深入推進(jìn)鐵路運(yùn)輸供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革,發(fā)揮云南省首家5A級(jí)綜合型物流企業(yè)優(yōu)勢(shì),累計(jì)完成貨物發(fā)送2.92億噸,其中出省物資外運(yùn)1.4億噸。

        1.3.2 CCK-8法評(píng)價(jià)化合物QDGS-6對(duì)A549、16HBE細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用

        配成1×105個(gè)/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞懸液,參照文獻(xiàn)[17]的方法評(píng)價(jià)QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。QDGS-6作用濃度分別為:6.25、12.5、25、50、100、200μm;齊墩果酸作用濃度分別為25、50、100、175、200、350μm;5-氟尿嘧啶作用濃度分別為25,50、100、200、300、400 μm,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。匯總數(shù)據(jù),計(jì)算其抑制率與IC50。

        配成5×104個(gè)/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞懸液后,按同樣的方法評(píng)價(jià)QDGS-6對(duì)其的毒性。QDGS-6作用濃度分別為:6.25、12.5、25、50、100、200μm;齊墩果酸作用濃度分別為50、100、175、200、300μm;5-氟尿嘧啶作用濃度分別為25、50、100、200、300、400μm,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。匯總數(shù)據(jù),計(jì)算其抑制率與CC50。

        1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

        參照文獻(xiàn)[17]的方法檢測(cè)QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。設(shè)立:對(duì)照組(不含任何藥物的RPMI 1640完全培養(yǎng)基),實(shí)驗(yàn)藥物組(QDGS-6作用濃度分別為:50、100、200μm,對(duì)應(yīng)高中低3種濃度組),陽(yáng)性藥組(5-氟尿嘧啶作用濃度為400μm)。

        1.3.4 Caspase-3試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞中Caspase-3活性

        參照文獻(xiàn)[17]的方法檢測(cè)QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞中Caspase-3活性影響。設(shè)立:對(duì)照組(不含任何藥物的RPMI 1640完全培養(yǎng)基),實(shí)驗(yàn)藥物組(QDGS-6作用濃度分別為:50、100、200μm,對(duì)應(yīng)高中低3種濃度組),陽(yáng)性藥組(5-氟尿嘧啶作用濃度為400μm)。

        2 結(jié)果

        2.1 齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物對(duì)A549細(xì)胞與16HBE細(xì)胞的增殖抑制作用

        表1 QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        表1 QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        組別/μm抑制率/%24 h 48 h 72 h 6.25 0.08±0.03 1.48±0.53 4.07±1.26 12.5 1.09±0.67 8.52±3.17 12.71±2.43 25 2.10±0.34 15.15±2.96 20.12±4.34 50 13.76±4.61 32.68±4.78 42.82±5.62 100 39.97±7.54 75.12±3.66 92.26±2.91 200 83.17±2.27 97.35±1.43 98.96±1.16

        表2 齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        表2 齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        組別/μm抑制率/%24 h 48 h 72 h 25 5.54±1.41 11.48±3.12 22.46±2.22 50 16.67±1.78 21.63±1.84 27.72±2.89 100 28.32±1.38 38.31±3.07 41.02±5.14 175 40.12±3.52 42.34±3.89 56.82±1.03 200 51.75±3.86 57.29±1.85 77.26±3.96 350 73.28±1.37 92.35±2.63 97.87±1.86

        表3 5-氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        表3 5-氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        組別/μm抑制率/%24 h 48 h 72 h 25 4.68±1.98 6.59±2.83 20.16±3.77 50 13.37±3.64 17.63±3.62 28.53±2.24 100 21.26±2.61 23.34±1.16 34.77±1.87 200 41.32±2.36 53.79±1.24 60.91±3.74 300 52.38±4.64 71.26±2.59 84.52±2.09 400 59.24±2.02 79.35±3.36 91.32±2.44

        不同濃度的QDGS-6、齊墩果酸和5-氟尿嘧啶分別作用于16HBE細(xì)胞不同24、48、72 h后的增殖抑制率分別如表4、5、6所示。隨著藥物濃度的增大以及作用時(shí)間的延長(zhǎng),QDGS-6、齊墩果酸和5-氟尿嘧啶的抑制作用都有不同程度地變強(qiáng)。其中QDGS-6作用于16HBE細(xì)胞24、48、72 h的CC50分別為146、98、62μm;齊墩果酸作用于16HBE細(xì)胞24、48、72 h的CC50分別為107、89、71μm;5-氟尿嘧啶作用于16HBE細(xì)胞24、48、72 h的CC50分別為5 505、74、48μm。

        表4 QDGS-6對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        表4 QDGS-6對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        組別/μm抑制率/%24 h 48 h 72 h 6.25 6.21±1.14 11.75±3.33 13.77±5.44 12.5 7.82±3.07 17.95±3.46 19.29±2.82 25 19.14±3.83 28.64±6.22 34.77±4.05 50 33.62±2.67 46.83±1.69 68.29±3.87 100 41.96±6.01 49.36±5.19 79.87±2.59 200 76.91±5.96 92.53±2.94 99.83±0.52

        表5 齊墩果酸對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        表5 齊墩果酸對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        組別/μm抑制率/%24 h 48 h 72 h 50 23.04±6.21 34.79±4.95 37.84±3.08 100 35.71±7.10 43.38±3.58 55.06±6.47 175 49.50±3.11 56.52±4.21 88.71±3.35 200 97.75±2.04 96.58±1.56 99.78±1.86 350 98.17±2.48 96.49±1.24 99.32±0.73

        表6 5-氟尿嘧啶對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        表6 5-氟尿嘧啶對(duì)16HBE細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

        組別/μm抑制率/%24 h 48 h 72 h 25 12.96±2.33 31.21±2.13 38.03±2.54 50 15.67±0.34 42.64±1.48 44.78±3.63 100 18.67±3.28 52.37±2.88 67.47±2.42 200 23.09±2.19 69.54±2.73 91.25±1.10 300 27.07±2.56 79.13±3.81 94.69±1.76 400 29.21±1.28 83.3±1.07 95.39±1.35

        綜上可得到表7,隨著藥物濃度的增大以及作用時(shí)間的延長(zhǎng),QDGS-6對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549的增殖抑制作用也增強(qiáng),表明QDGS-6對(duì)A549存在劑量和時(shí)間的依賴性。通過(guò)比較QDGS-6、齊墩果酸和5-氟尿嘧啶的IC50,可知QDGS-6具有更強(qiáng)的抗非小細(xì)胞肺癌A549的活性。通過(guò)比較選擇系數(shù)(selection index,SI)可知QDGS-6在細(xì)胞水平上較齊墩果酸與5-氟尿嘧啶更為安全。

        表7 3種化合物對(duì)A549、16HBE細(xì)胞的增殖抑制影響

        2.2.3 QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

        如圖2所示,QDGS-6作用于A549細(xì)胞24 h后,隨著QDGS-6濃度的增加,A549細(xì)胞的凋亡率也增加,呈現(xiàn)劑量依賴性。高濃度組的凋亡率為67.0%(63.5%早期凋亡+3.5%晚期凋亡),中濃度組的凋亡率為25.84%(19.0%早期凋亡+6.84%晚期凋亡),低濃度組的凋亡率為15.78%(9.23%早期凋亡+6.55%晚期凋亡),陽(yáng)性藥組的凋亡率為20.36%(18.9%早期凋亡+1.46%晚期凋亡),對(duì)照組凋亡率為12.55%。提示QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞有著顯著的促凋亡作用。

        圖2 不同劑量QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響圖

        2.2 QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞中Caspase-3活性的影響

        通過(guò)以陽(yáng)性藥和不同濃度的QDGS-6處理A549細(xì)胞24 h后,再以caspase-3檢測(cè)試劑盒和Bradford試劑盒測(cè)定得到caspase-3的相對(duì)酶活力值,考察caspase-3是否參與了A549細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Bradford標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示,R2=0.99,說(shuō)明蛋白濃度范圍為0~1.5 mg/mL時(shí),BSA濃度與OD值的線性關(guān)系良好,公式為y=0.540 3x+0.529 8。pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,R2=0.999 3,說(shuō)明pNA濃度范圍為0~200μm時(shí),pNA濃度與OD值的線性關(guān)系良好,公式為y=0.0026x+0.005。

        Caspase-3的相對(duì)酶活力單位結(jié)果如圖5所示。隨著藥物濃度的增加,caspase-3的相對(duì)酶活力單位也相應(yīng)增加。提示QDGS-6可以增強(qiáng)A549細(xì)胞中Caspase-3的活性,這可能是QDGS-6誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

        圖3 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

        圖4 pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

        圖5 不同劑量QDGS-6對(duì)A549細(xì)胞Caspase 3活性的影響直方圖

        3 討論

        以齊墩果酸為先導(dǎo)化合物,通過(guò)氧化、鮑奇還原胺化、縮合等反應(yīng)得到了齊墩果酸衍生物QDGS-6,通過(guò)質(zhì)譜、核磁共振的方法確證了該結(jié)構(gòu)為3-N-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲?;?齊墩果酸,同時(shí)通過(guò)文獻(xiàn)檢索、Reaxys和Scifinder等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì),確定了QDGS-6為齊墩果酸新型衍生物。體外活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,QDGS-6活性相對(duì)原料藥和陽(yáng)性藥有了明顯提高,在細(xì)胞水平上的安全性更強(qiáng),提示齊墩果酸類衍生物在可抑制癌細(xì)胞增殖的同時(shí),毒性更低。且QDGS-6可誘導(dǎo)A549細(xì)胞株凋亡,增強(qiáng)Caspase-3的酶活性可能是其機(jī)制。Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游中最重要的凋亡執(zhí)行者,Bcl-2與Bax蛋白既可作為上級(jí)調(diào)控機(jī)制,又可作為Caspase-3的下游直接底物。為了進(jìn)一步探尋QDGS-6誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制,可檢測(cè)Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)情況。

        首次將齊墩果酸與川芎嗪以酰胺鍵拼合在一起,在體外活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),齊墩果酸衍生物QDGS-6的抗非小細(xì)胞肺癌的活性相對(duì)于齊墩果酸提升的幅度不大,同時(shí)其溶解性未得到明顯改善,提示該類結(jié)構(gòu)口服體內(nèi)生物利用度可能較低。湯義等[18]通過(guò)在齊墩果酸C-3位連接單糖基,使齊墩果酸衍生物的親水性基團(tuán)得到了增加,改善了化合物的溶解性與活性,提示齊墩果酸可以通過(guò)連接糖苷類化合物,引入如羧基等親水性基團(tuán),從而得到溶解性更好的化合物。

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