開梓翔，劉春，2△，劉宇翔，徐彬，郭亞雄

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，太原 030001)

1 引 言

細(xì)菌感染給醫(yī)療、公共衛(wèi)生、社會經(jīng)濟(jì)帶來了巨大的壓力[1-2]，過量和不當(dāng)使用抗生素對抗細(xì)菌，易導(dǎo)致細(xì)菌基因突變產(chǎn)生耐藥性，給生物安全帶來了巨大的威脅[3-4]。近年來，許多研究致力于開發(fā)非抗生素類抗菌劑，其中納米銀(Ag nanoparticles，Ag NPs)和納米氧化銅(CuO nanoparticles，CuO NPs)作為無機(jī)抗菌劑的代表，具有廣譜抗菌作用，且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥，獲得了極高的關(guān)注[5-6]。制備納米級金屬粒子的關(guān)鍵是還原劑的選擇。使用水合肼作還原劑制備Ag NPs[7]，毒副作用強(qiáng)不適于醫(yī)用；利用海藻酸鈉[8]或獐牙菜提取物[9]等天然化合物，又存在工藝復(fù)雜、制備時(shí)間長等缺陷。Raghavendra等[10]成功利用殼聚糖制備出CuO NPs，卻依舊無法避免需要特殊處理以增強(qiáng)殼聚糖水溶性的問題。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)作為一種殼聚糖的衍生物來源廣價(jià)格低，具有還原能力，能促進(jìn)傷口愈合，且生物相容性良好、無毒、綠色環(huán)保，同時(shí)還具有一定的廣譜抗菌能力[11-12]，相比于殼聚糖水溶性更強(qiáng)。本研究利用CMCS的還原穩(wěn)定性，在堿性體系下通過水熱法制備羧甲基殼聚糖復(fù)合納米銀(CMCS-Ag NPs)以及羧甲基殼聚糖復(fù)合納米氧化銅(CMCS- CuO NPs)，并測試比較其體外抑制大腸桿菌的能力，為開發(fā)醫(yī)用抗菌材料提供一種選擇方案。

2 材料與方法

2.1 材料制備

2.1.1主要原料和試劑 CMCS(分子量9 000 Da)，上海麥克林生化科技有限公司；AgNO3、CuSO4·5H2O、NaOH，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；所有溶液均采用實(shí)驗(yàn)室自制去離子水配制。

2.1.2分析測試儀器 UV-1800型紫外可見光分光度計(jì)(UV-vis)，掃描范圍200～800 nm，掃描步長0.5 nm，日本Shimadzu公司；D8 Advance型X射線粉末衍射儀(XRD)，掃描范圍5～85°，掃描步長0.5°，德國BRUKER公司；JEM2010型透射電子顯微鏡(TEM)，分辨率1.9 ?，工作電壓120 kv，日本JEOL公司。

2.1.4CMCS- CuO NPs的制備 在室溫條件下，將90 mg CuSO4·5H2O和45 mg CMCS分別溶于10 mL的去離子水中。在60℃下，將CuSO4溶液緩慢滴加入CMCS溶液中并恒溫恒速攪拌15 min后，升溫至100℃，利用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至堿性。保持堿性環(huán)境反應(yīng)30～40 min，溶液逐漸由淡藍(lán)色變?yōu)楹谏珣覞嵋?。將混合溶液透析去雜質(zhì)后，采用真空冷凍干燥法，得到黑色的CMCS- CuO NPs粉末。

2.1.5大腸桿菌的培養(yǎng) 將大腸桿菌以平板劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取較大的細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)24 h。抽取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的菌液，用PBS緩沖液反復(fù)離心洗滌后，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ肙D值調(diào)整稀釋菌液濃度，以獲得一定濃度的細(xì)菌懸液(大約4×108CFU/mL)。用PBS緩沖液制備一系列濃度梯度的細(xì)菌懸液以備后用。

2.2 表征測試

2.2.1實(shí)驗(yàn)制備的樣品進(jìn)行表征測試 UV-vis可顯示單質(zhì)銀的特征吸收峰，通過XRD分析得到衍射圖譜確定物質(zhì)的成分等。TEM可以觀察樣品的形貌、粒徑尺寸、粒態(tài)分布等。

2.2.2用平板菌落計(jì)數(shù)法分別測定CMCS-Ag NPs、CMCS- CuO NPs的抗菌活性 根據(jù)文獻(xiàn)[13]所展示的方法進(jìn)行改良抗菌試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組將一定質(zhì)量的CMCS-Ag NPs和CMCS- CuO NPs分別溶入到10 mL的大腸桿菌懸濁液(105CFU/mL)中，記為A組(2 mg/100 mL CMCS-Ag NPs)、B組(4 mg/100 mL CMCS-Ag NPs)、C組(2 mg/100 mL CMCS- CuO NPs)、D組(4 mg/100 mL CMCS-CuO NPs)，對照組采用同條件下等量的未溶入抗菌材料的大腸桿菌懸濁液(105CFU/mL)。實(shí)驗(yàn)組、對照組均在37℃恒溫條件下，搖床震蕩培養(yǎng)18～24 h，然后將各組分別用移液槍抽取100 μL混合溶液，滴到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線涂板(每組涂板三份)。將各組平板在37℃下恒溫恒濕培養(yǎng)24 h后進(jìn)行活菌落計(jì)數(shù)。相同條件下不同時(shí)間內(nèi)重復(fù)三次上述實(shí)驗(yàn)。抑菌率計(jì)算采用以下公式：

抑菌率(%)=(對照組菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)×100

3 結(jié)果與討論

3.1 CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs的溶液表觀

CMCS-Ag NPs溶液呈黃褐色、溶解度高、水溶性良好，與之對比CMCS- CuO NPs溶液呈黑色、懸濁狀，溶解度相對較低。靜置120 d后，所有CMCS-Ag NPs樣品溶液均無結(jié)塊或沉淀，也無明顯的顏色變化；CMCS- CuO NPs樣品懸濁液出現(xiàn)沉降現(xiàn)象。由于Ag NPs易氧化，利用UV-vis測定靜置后的CMCS-Ag NPs樣品溶液，對比發(fā)現(xiàn)，光譜無明顯變化，說明該方法制備的CMCS-Ag NPs 不易氧化，具有較高的穩(wěn)定性。CMCS起到還原劑、穩(wěn)定劑的作用，吸附在Ag NPs和CuO NPs表面，防止納米粒子團(tuán)聚，且能不同程度改善二者溶解性，CMCS-Ag NPs的溶解性更強(qiáng)。

3.2 CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs的表征

CMCS-Ag NPs溶解性強(qiáng)，可以利用UV-vis的紫外可見光譜研究確定溶液中Ag NPs的存在，這是由于它在紫外可見區(qū)(380～450 nm)激發(fā)了表面等離子體共振，因此該實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是一種簡單而敏感的表征銀納米粒子的技術(shù)[14]。紫外可見光譜研究展示所有的CMCS-Ag NPs樣品均在約410 nm左右表現(xiàn)出Ag NPs的特征吸收峰，且吸收帶較窄，說明Ag NPs粒子的直徑分布較窄。由于CMCS- CuO溶液呈懸濁狀，無法行UV-vis測試。CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs的XRD測試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)卡片對比，分別證明含有單質(zhì)銀或氧化銅的特征衍射峰，未出現(xiàn)其他雜質(zhì)的衍射峰，說明復(fù)合材料雜質(zhì)少較純凈。TEM測試了CMCS-Ag NPs 、CMCS- CuO NPs的形貌和粒態(tài)分布，結(jié)果表明，本研究制備的CMCS-Ag NPs、CMCS- CuO NPs在CMCS基體中均具有良好的分散性，顆粒尺寸直徑相近，幾乎不存在團(tuán)聚現(xiàn)象。CMCS-Ag NPs復(fù)合材料中的Ag NPs粒子大部分為球形或近似球形，尺寸集中分布在20～30 nm(見圖1)，CMCS- CuO NPs復(fù)合材料中的CuO NPs呈現(xiàn)典型四葉花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，尺寸集中于80～100 nm(見圖2)。

圖1 CMCS-Ag NPs的TEM圖譜Fig.1 TEM spectra of CMCS-Ag NPs

圖2 CMCS- CuO NPs的TEM圖譜Fig.2 TEM spectra of CMCS- CuO NPs

3.3 CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs的體外抑菌對比研究

大腸桿菌是最常見的人類致病菌之一，革蘭氏染色陰性，可通過不同的毒力因子如毒素、菌毛、脂多糖等誘發(fā)感染[15]。近年來，臨床上抗生素類抗菌藥物的廣泛使用，加速了大腸桿菌等致病菌的耐藥基因突變，使其耐藥性大大增加，嚴(yán)重危害生物安全，因此亟待開發(fā)新型抗菌制劑以規(guī)避以大腸桿菌為代表的致病菌產(chǎn)生耐藥性的問題。

本研究制備的CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs復(fù)合材料均具有極強(qiáng)的抑制大腸桿菌的能力。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，A組、B組的大腸桿菌抑菌率分別為(92.6±0.8)%和(97.8±1.9)%(P<0.05)，表明CMCS-Ag NPs對于大腸桿菌具有明顯的殺菌作用。有研究認(rèn)為，Ag NPs可以通過產(chǎn)生自由基來破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，降低某些膜酶的活性，導(dǎo)致錯(cuò)誤的的營養(yǎng)和信號供應(yīng)，最終產(chǎn)生致命的損傷引發(fā)大腸桿菌死亡[16-17]。而對于CMCS- CuO NPs，實(shí)驗(yàn)顯示C組、D組的抑菌率分別為(89.4±1.4)%、(95.3±1.6)%(P<0.05)，這可能是由于CuO NPs能穿透細(xì)菌細(xì)胞膜或包裹于細(xì)胞膜之中，誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)泄露，剝奪其與外界物質(zhì)交換的能力，最終加速細(xì)菌裂解[18]。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs均具有明顯的抑制大腸桿菌的能力，但前者更佳。CMCS-Ag NPs在低濃度(2 mg/100 mL)下就可以表現(xiàn)出殺菌效果，而在此濃度下CMCS- CuO NPs僅表現(xiàn)出抑菌效果，在較高濃度(4 mg/100 mL)下二者均表現(xiàn)出殺菌效果；同時(shí)該抑菌能力呈現(xiàn)劑量依賴性，相比于低濃度的A組、C組(2 mg/100 mL)而言，高濃度的B組、D組(4 mg/100 mL)抑菌率更高(見圖3)。

圖3 不同濃度 CMCS-Ag NPs 和CMCS- CuO NPs的抑菌率對比

傳統(tǒng)抑菌劑主要是抗生素類藥物，通過不同方式破壞不同種類細(xì)菌的細(xì)胞膜或者干擾細(xì)菌遺傳物質(zhì)，從而抑制或殺死細(xì)菌。然而抗生素類藥物通常僅針對某一類細(xì)菌，單一使用難以達(dá)到廣譜殺菌效果，且使用過程中容易引發(fā)細(xì)菌基因突變產(chǎn)生耐藥性，危害生物安全[3]。革蘭氏陽性或陰性菌表面通常攜帶負(fù)電荷，而微小的納米級金屬類不僅可以穿透細(xì)胞膜，還可以通過釋放陽離子產(chǎn)生靜電作用破壞細(xì)胞膜，從而殺死細(xì)菌。此外，納米金屬類產(chǎn)生的氧自由基對殺菌也起到了重要作用[19]。因此，納米級金屬類抗菌劑的殺菌方式?jīng)Q定其擁有廣譜抗菌能力，針對革蘭氏陽性或陰性菌均能發(fā)揮效應(yīng)，而且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥，相較抗生素類藥物抗菌性能優(yōu)秀且更有利于生物安全。

3.4 討論

細(xì)菌感染是醫(yī)學(xué)中十分突出的問題，抗生素的應(yīng)用是百年來最具成效的解決辦法，然而隨著臨床觀察與研究，抗生素的耐藥問題已不容忽視。無機(jī)抗菌劑的代表Ag NPs及CuO NPs具有極佳的抗菌性能，然而易團(tuán)聚、穩(wěn)定性差。許多研究者采用化學(xué)制劑等作為還原穩(wěn)定劑，過程復(fù)雜、難以提純、毒性高，不利于應(yīng)用于人體[7，20]。CMCS屬于殼聚糖的衍生物，來源廣泛且具有廣譜抗菌、止血等功效，尤其還具備還原穩(wěn)定性，在醫(yī)藥領(lǐng)域逐漸受到重視。結(jié)合CMCS的還原穩(wěn)定特性以及納米級金屬或金屬氧化物的廣譜抗菌性，本研究制備了CMCS-Ag NPs及CMCS- CuO NPs復(fù)合型納米抗菌劑，原材料來源廣、工藝簡單且綠色，未引入毒性高的化學(xué)還原劑。制備的Ag NPs粒子尺寸20～30 nm，CuO NPs粒子尺寸80～100 nm，與其他研究者報(bào)道的Ag NPs粒子尺寸10～55 nm[8-9]、CuO NPs粒子尺寸20～600 nm[10，21]相比，尺寸類似甚至相對較小，而小尺寸的納米級金屬的抗菌性能強(qiáng)[22]，同時(shí)穩(wěn)定性高，水溶性佳，溶液狀態(tài)均質(zhì)且穩(wěn)定，易于通過液態(tài)反應(yīng)與其他物質(zhì)摻雜以便進(jìn)一步應(yīng)用。通過平板菌落計(jì)數(shù)法測試比較針對最常見的致病菌即革蘭氏陰性大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二者均具有極強(qiáng)的劑量依賴性的抑菌能力，相同濃度對比CMCS-Ag NPs的抑菌能力優(yōu)于CMCS- CuO NPs，2 mg/100 mL濃度下的CMCS-Ag NPs便可抑制90%以上的大腸桿菌，呈現(xiàn)殺菌效應(yīng)；而CMCS- CuO NPs在4 mg/100 mL下可以表現(xiàn)出殺菌效果。本研究目前僅針對具有代表性的革蘭氏陰性大腸桿菌進(jìn)行抑菌研究，未進(jìn)行生物相容性評價(jià)，后續(xù)可根據(jù)不同的抗菌應(yīng)用方向，針對性地補(bǔ)充相關(guān)菌種的抗菌研究及生物相容性評估。當(dāng)前已有研究將CMCS-Ag NPs、CMCS- CuO NPs應(yīng)用于醫(yī)用敷料[23]等，未來本研究將進(jìn)一步改良，將CMCS-Ag NPs及CMCS- CuO NPs復(fù)合型納米抗菌劑開發(fā)更廣泛的用途。

4 結(jié)論

本研究以Ag NPs和CuO NPs粒子與CMCS相結(jié)合制備了復(fù)合型納米抗菌劑。在堿性環(huán)境下，通過水熱法利用CMCS將Ag+、Cu2+氧化成Ag NPs或CuO NPs，并保持粒子的穩(wěn)定。通過UV-vis和XRD分析證實(shí)了CMCS基質(zhì)中Ag NP或CuO NPs粒子的形成。TEM顯示Ag NPs粒子為球形或近似球形，尺寸為20～30 nm，CuO NPs為四葉花瓣?duì)?，尺寸約80～100 nm。研究制備的兩種復(fù)合型納米抗菌劑對大腸桿菌均具有良好的抑制作用?；谝陨辖Y(jié)果，本研究制備的CMCS-Ag NPs及CMCS- CuO NPs復(fù)合型納米抗菌劑，在后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)改良和研究評價(jià)，有望應(yīng)用于不同的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)藥行業(yè)，發(fā)揮抗菌、抗感染的功效。