周靜媛，劉肖珩，沈陽，曾燁，陳宇△，蔣文濤

(1.四川大學(xué)生物力學(xué)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

1 引 言

由于臨床試驗(yàn)成本高、時(shí)間長，動(dòng)物模型在骨質(zhì)疏松癥治療藥物的鑒定和選擇中起著至關(guān)重要的作用。針對(duì)不同類型的骨質(zhì)疏松，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生骨質(zhì)疏松的方法并不相同，有效的藥物對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用如何體現(xiàn)也需要考慮，因此，構(gòu)建骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的方法及藥物具有治療作用的判斷依據(jù)的發(fā)展與完善將越來越重要。我們介紹了現(xiàn)有的構(gòu)建骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的方法、給藥實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法及藥物具有治療作用的判斷依據(jù)，并為研發(fā)治療骨質(zhì)疏松的新型藥物的選擇提供思路。

2 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型構(gòu)建及給藥實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法

原發(fā)性骨質(zhì)疏松是隨著年齡增長必然發(fā)生的一種生理退行性病變，可分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(I型)和老年骨質(zhì)疏松(II型)。其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于機(jī)體內(nèi)雌激素水平下降，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同維持的骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，導(dǎo)致骨質(zhì)流失增加，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素具有明顯的抗氧化作用，雌激素的缺乏可能會(huì)損害抗氧化系統(tǒng)并導(dǎo)致骨骼中氧化應(yīng)激水平增加，導(dǎo)致骨吸收增加和骨形成減少，引發(fā)骨質(zhì)疏松[2]。而老年骨質(zhì)疏松是指隨著年齡增加，人體單位體積骨量低于正常，骨小梁間隙增大，骨基質(zhì)減少，骨強(qiáng)度降低所造成的骨質(zhì)疏松。

2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松

絕經(jīng)期雌激素缺乏引起的骨轉(zhuǎn)換加速是骨質(zhì)疏松癥最常見的原因，因此，在臨床的治療藥物檢查中，因雌激素缺乏而產(chǎn)生骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型是首選。

大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型對(duì)研究原發(fā)性骨質(zhì)疏松有積極意義，目前廣泛使用的動(dòng)物模型是Wistar大鼠，周齡大多為12周，要求健康特異性無病原體。廣泛用于動(dòng)物模型造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的方法是雙側(cè)卵巢切除法(去勢(shì)法)[3-6]。

選取大鼠后，對(duì)大鼠進(jìn)行手術(shù)并分為假手術(shù)組和去卵巢組，分組過程中，應(yīng)保持每組的大鼠數(shù)量相同。假手術(shù)組有兩種處理方式：一是麻醉之后只切除一小部分脂肪，而不是雙側(cè)卵巢[1]；二是由于采用2%異氟烷麻醉大鼠，假手術(shù)組切口縫合而不切除卵巢[5]。去卵巢組又分為模型組和藥物作用組。藥物作用組可根據(jù)需要設(shè)置高劑量藥物組、中劑量藥物組、低劑量藥物組等，以對(duì)藥物作用的最佳用量進(jìn)行大概估計(jì)。設(shè)置藥物用量時(shí)，應(yīng)注意基于人體的用量進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可采用人與大鼠之間的劑量轉(zhuǎn)換表來得到用量[3]。 治療期過后，對(duì)大鼠進(jìn)行安樂死，取血樣進(jìn)行生化分析，采集左/右股骨、子宮、陰道，將用于組織學(xué)分析的樣品保持在10%中性甲醛中。

2.2 老年骨質(zhì)疏松

依舊選用大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，可選擇SD(Sprague Dawley)大鼠作為動(dòng)物模型，不限制動(dòng)物性別，大鼠此時(shí)的骨頭已經(jīng)發(fā)生生理性退化，可采取雙能X射線吸收測(cè)定法測(cè)定骨密度與骨礦含量，將老年大鼠的測(cè)定結(jié)果與3月齡大鼠的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)一步證實(shí)老年大鼠的骨質(zhì)疏松的發(fā)生[7]。

選取大鼠后，需將老年大鼠平均分為模型組與藥物作用組，模型組不做其他處理，藥物作用組可根據(jù)需要設(shè)置N(N≥1)組，每組作用不同劑量的藥物。

與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松不同的是，研究老年骨質(zhì)疏松，若需要明確骨質(zhì)疏松造成的影響，則需要設(shè)置同等數(shù)量的低月齡大鼠(未發(fā)生老年骨質(zhì)疏松)作為模型組的對(duì)照組[7]，而研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響，只需要將假手術(shù)組與模型組進(jìn)行對(duì)照。另外，以老年骨質(zhì)疏松為研究對(duì)象時(shí)，無需進(jìn)行手術(shù)獲得骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，但大鼠的月齡應(yīng)控制在15個(gè)月以上，以盡可能再現(xiàn)人類骨質(zhì)疏松的狀態(tài)。此外，需要注意的是，21個(gè)月以上的大鼠由于雌激素的缺乏, 雌性大鼠乳腺腫瘤發(fā)病率上升, 已不適合用于骨代謝研究。

3 繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型構(gòu)建及給藥實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法

繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是指由于疾病或藥物等原因所致的骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的病因有很多，包括藥物治療、甲狀腺功能亢進(jìn)、維生素D缺乏、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)等。

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(GC-induced osteoporosis，GIO)是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的常見形式，是導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加的一個(gè)原因[8]。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)是治療炎癥性和風(fēng)濕性疾病的廣泛藥物。 然而，GCs可通過抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化，增加骨脆性和骨折的概率[9]，導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松甚至骨壞死。據(jù)估計(jì)，30%～50%的接受長期GCs治療的患者會(huì)發(fā)生糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松[10]。

大鼠糖皮質(zhì)激素性動(dòng)物模型對(duì)研究人類糖皮質(zhì)激素引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松有積極意義，目前廣泛使用的動(dòng)物模型是SD大鼠和Wistar大鼠，周齡大多為8周[11]或12周[9-10]，目前廣泛用于動(dòng)物模型上誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松的藥物是地塞米松[9-11]，該藥物是一種人工合成的強(qiáng)效、長效糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗過敏、抗休克作用，易獲得且價(jià)格便宜。

大鼠糖皮質(zhì)激素性動(dòng)物模型建立之后，設(shè)置樣本對(duì)照組、模型組和藥物作用組，藥物作用組的動(dòng)物已被地塞米松誘導(dǎo)，患有骨質(zhì)疏松GIO，每組大鼠數(shù)量相同，藥物用量不同，設(shè)置多組實(shí)驗(yàn)組，避免實(shí)驗(yàn)偶然性，同時(shí)，有望通過多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，找出治療GIO的藥物的最佳用量[12]。某些藥物被提取出來之后是以結(jié)晶粉末的形式存在，給藥時(shí)，需要根據(jù)其溶解性溶于助溶劑中[13]。處死大鼠后，取其股骨和血清作進(jìn)一步評(píng)估。

4 藥物具有治療作用的判斷依據(jù)

對(duì)于不同類型的骨質(zhì)疏松，實(shí)驗(yàn)分組見圖1。

圖1 各類骨質(zhì)疏松動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)分組Fig.1 Experimental group of animal experiments on osteoporosis

以大鼠為模型研究不同類型的骨質(zhì)疏松時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的分組可分為空白對(duì)照組、模型組與藥物作用組。圖1中假手術(shù)組、低月齡組、樣本對(duì)照組均屬于空白對(duì)照組，由于股骨是最容易骨折的部位[13],在骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中，大都以股骨為研究對(duì)象來測(cè)定骨密度、骨礦含量等，在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，測(cè)得各類指標(biāo)之后，模型組與空白對(duì)照組對(duì)照，得出患有骨質(zhì)疏松對(duì)各類指標(biāo)的影響，藥物作用組與模型組對(duì)照，得出藥物治療后，骨質(zhì)疏松的改善情況。

藥物是否具有治療作用需要客觀的指標(biāo)來判斷?，F(xiàn)有的判斷指標(biāo)主要有骨量變化、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定、血樣生化參數(shù)、骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)等。其中，骨量變化和骨組織顯微結(jié)構(gòu)變化與骨生物力學(xué)性能是主要指標(biāo)，各類指標(biāo)見表1。

表1 藥效判斷指標(biāo)Table 1 Pharmacodynamic index

值得注意的是，在對(duì)血清中的鈣、磷進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，鈣、磷水平變化不明顯[3]，因此，該項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)作為輔助指標(biāo)。對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松而言，由于該類型骨質(zhì)疏松的發(fā)病與雌激素的減少有關(guān)，在比較各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)，可增加對(duì)雌二醇的檢測(cè)[1，3]，若藥物能提高動(dòng)物體內(nèi)的雌二醇水平，可進(jìn)一步評(píng)定藥物有效，另外，可以計(jì)算出大鼠子宮、陰道等的器官系數(shù)，器官系數(shù)提高，表明藥物對(duì)子宮和陰道組織有保護(hù)作用，器官系數(shù)計(jì)算公式如下[3]：

(1)

(2)

最后，相比老年骨質(zhì)疏松而言，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，經(jīng)過藥物治療后，骨鈣素水平會(huì)降低得更為明顯，因此，骨鈣素是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物研究中的一個(gè)重要指標(biāo)，在老年骨質(zhì)疏松中重要程度較低。以上指標(biāo)均能從不同方面反映骨質(zhì)疏松的治療情況，需要對(duì)多種指標(biāo)進(jìn)行全面分析，才能得到關(guān)于藥物治療效果的全面判斷。

5 改進(jìn)骨質(zhì)疏松治療方案的實(shí)驗(yàn)方法

骨質(zhì)疏松癥的特征是低骨量、易骨折。由于骨質(zhì)疏松癥涉及到骨形成減少和骨吸收增加，很明顯可以通過聯(lián)合抗吸收和骨合成的藥物來治療骨質(zhì)疏松癥；另外，某些治療骨質(zhì)疏松合成代謝藥物存在治療窗口不長，患者對(duì)注射這些藥物的依從性較差，患者有針頭恐懼癥等問題，這種情況下，可從給藥方式進(jìn)行優(yōu)化，如將皮下注射改為鼻腔給藥等。

因此，研究聯(lián)合藥物進(jìn)行治療和改變給藥方式對(duì)研究骨質(zhì)疏松具有重要意義。

5.1 聯(lián)合藥物進(jìn)行治療

對(duì)于聯(lián)合藥物的研究，大鼠糖皮質(zhì)激素性動(dòng)物模型建立之后，對(duì)大鼠進(jìn)行分組，注意每組大鼠數(shù)量應(yīng)該相同。實(shí)驗(yàn)分組見圖1，就藥物作用組而言，設(shè)置靜脈注射兩種藥物聯(lián)合組，單獨(dú)抗吸收藥物組，單獨(dú)骨合成藥物組，并注意聯(lián)合作用藥物組的藥物用量可根據(jù)劑量反應(yīng)的研究成果來確定[15]或設(shè)置為單獨(dú)藥物作用時(shí)的含量的疊加[7]。在治療結(jié)束時(shí)，采集大鼠血清和股骨，對(duì)表1中各類指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，若聯(lián)合藥物的療效好于單獨(dú)的藥物作用情況，證實(shí)聯(lián)合藥物具有一定的可行性。

5.2 改變給藥方式

選取健康SD大鼠，設(shè)置鼻腔給藥組、皮下注射組，評(píng)價(jià)鼻腔噴霧劑治療骨質(zhì)疏松的潛力，鼻腔噴霧劑有效性的關(guān)鍵因素是藥代動(dòng)力學(xué)，若結(jié)果顯示鼻腔噴霧劑在大鼠模型中具有與皮下注射等效的藥代動(dòng)力學(xué)曲線，峰值血藥濃度相當(dāng)，證明該藥物可由鼻腔給藥[16]。

6 治療骨質(zhì)疏松的新型藥物的選擇方向

綜合原發(fā)性骨質(zhì)疏松與繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行考慮，研發(fā)新藥時(shí)，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行選擇：

(1)對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松而言，由于雌激素減少導(dǎo)致容易氧化，可選擇具有抗氧化性能的物質(zhì)[1，6]；

(2)具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化提高成骨作用的物質(zhì)[9]和抑制破骨細(xì)胞骨吸收的物質(zhì)[17]都可作為備選研發(fā)藥物；

(3)從治療其他疾病的藥物中進(jìn)行選擇[17-18]；

(4)根據(jù)以往的研究，在統(tǒng)計(jì)上去除體重的機(jī)械負(fù)荷效應(yīng)后，體脂質(zhì)量與骨量呈負(fù)相關(guān)，提示可以通過減重來增加骨量，從而預(yù)防骨質(zhì)疏松[1]；

7 總結(jié)

綜上所述, 根據(jù)研究目的的不同，需采取不同的方法建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，這對(duì)于骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理的研究、新藥研究、藥物的改進(jìn)均十分關(guān)鍵。目前，雙側(cè)卵巢切除法獲得原發(fā)性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型和激素誘導(dǎo)獲得繼發(fā)性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型是兩種常用方法。

總體來說，有效藥物應(yīng)能改善血液生化指標(biāo)，提高骨密度、骨礦含量及骨力學(xué)性能等。比較各類指標(biāo)，確認(rèn)藥物有效之后，也應(yīng)考慮藥物在治療骨質(zhì)疏松時(shí)的副作用、最佳用量、是否可以通過改變給藥方式或與其他藥物的聯(lián)合治療來增強(qiáng)療效等問題?？紤]繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的病因，今后的研究中，需要克服的問題還有如何控制會(huì)引起骨質(zhì)疏松的藥物(如糖皮質(zhì)激素等)的用量，使其既能有效治療病癥，又不會(huì)引起繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。隨著新技術(shù)的發(fā)展和骨質(zhì)疏松研究的不斷深入,相信建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型、藥物研發(fā)及提升藥物療效的方法將會(huì)越來越完善。

致謝

感謝國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目“骨質(zhì)疏松骨鈣流失與血管壁鈣鹽沉積：基質(zhì)囊泡介導(dǎo)鈣轉(zhuǎn)移的力學(xué)生物學(xué)機(jī)制(11932014)”的支持。