李艷菊 張戈 王曉靜 邢孝民 馬國詔

阿爾茨海默病是老年人最常見的神經(jīng)變性病，典型病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白（Aβ）沉積［1］。大量證據(jù)表明，Aβ可以導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)，上述變化反過來進(jìn)一步刺激Aβ的生成和沉積［2-3］。線粒體ATP敏感性鉀離子通道（KATP）的開放可以保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ的細(xì)胞毒性作用［4］。KATP廣泛表達(dá)于不同腦區(qū)，其亞基決定不同腦區(qū)對(duì)缺氧、氧化應(yīng)激、神經(jīng)毒性和血糖代謝等的耐受性不同［5］。Aβ1~42和ATP可以上調(diào)KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)［4-6］。業(yè)已證實(shí)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，目前已知核 因 子-κB（NF-κB）、p38絲裂原激 活 蛋 白 激 酶（MAPK）和蛋白激酶C（PKC）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與阿爾茨海默病的病理生理學(xué)機(jī)制密切相關(guān)，如NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阿爾茨海默病患者中表達(dá)增強(qiáng)［7］；阿爾茨海默病患者腦組織p38 MAPK磷酸化水平升高，與Aβ斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）有關(guān)［8-9］；Aβ寡聚體還可以破壞PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［10］等。進(jìn)一步研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)Aβ1~42上調(diào)KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)的影響，可以為通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶向治療阿爾茨海默病提供理論依據(jù)［11］?；诖?，本研究旨在探討NF-κB、p38 MAPK和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元Aβ1~42上調(diào)KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)中的作用，以期為上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)神經(jīng)元的作用提供新思路，同時(shí)也為研究防治阿爾茨海默病藥物提供新視角。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)的Wistar種系新生大鼠200只，雌雄不限，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK魯20090001），控制溫度（21℃）、光照（12 h晝-12 h夜）和相對(duì)濕度（50%~60%）。

2.設(shè)備與儀器 （1）主要藥品與試劑：Aβ1~42人工重組蛋白（規(guī)格0.10 mg）、SN50（規(guī)格1 mg）、SB203580（規(guī)格1 mg）、多聚賴氨酸（規(guī)格10 mg）、白屈菜紅堿（CTC，規(guī)格5 mg）均購自美國Sigma公司，Neurobasal培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，規(guī)格500 ml）均系美國Gibco公司產(chǎn)品，B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑（規(guī)格10 ml）購自美國Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基（規(guī)格500 ml）購自美國HyClone公司，鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）免疫組化檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均系武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，Ⅰ抗工作液包括山羊抗大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）抗體（規(guī)格0.10 ml，滴度1∶100）、兔抗大鼠Kir6.2多克隆抗體（規(guī)格0.10 ml，滴度1∶500）和兔抗大鼠SUR1多克隆抗體（規(guī)格0.10 ml，滴度1∶500），以及內(nèi)參照物甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗（規(guī)格0.10 ml，滴度1∶500）、生物素標(biāo)記的兔抗山羊IgGⅡ抗（規(guī)格0.10 ml，滴度1∶200）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，MgCl2、CaCl2、KCl、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O（均為分析純）固體粉末樣試劑為天津市廣成化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，NaCl、KH2PO4（均為分析純）固體粉末樣試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，二辛可寧酸（BCA）檢測試劑盒購自上海博彩生物科技有限公司，放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF；規(guī)格1 ml，濃度100 mmol/L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，電化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光液購自美國Millpore公司。（2）主要設(shè)備與儀器：光學(xué)顯微鏡（IM50）為德國Leica公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為日本SUNYO株式會(huì)社產(chǎn)品。

二、研究方法

1.原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 將新生大鼠從培養(yǎng)環(huán)境取出，于實(shí)驗(yàn)室無菌條件下，頭頸部消毒，以無菌剪刀在其枕下頸部行一倒“T”字口按皮膚、顱骨逐層剪開，剝除腦膜后分離出皮質(zhì)、海馬。75%乙醇溶液消毒后，在無菌條件下用顯微鑷分離大腦皮質(zhì)和海馬，D-Hanks溶液清洗，制備1 mm×1 mm×1 mm腦組織切片，以0.125%胰蛋白酶消化10 min，終止消化后采用300目不銹鋼網(wǎng)過濾；過濾液離心，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速1000 r/m離心5 min，獲得原代神經(jīng)細(xì)胞，以細(xì)胞密度為3×106/ml種植于多聚賴氨酸包被的60 mm培養(yǎng)皿（37℃培養(yǎng)箱，95%空氣和5%CO2）中，24 h后更換培養(yǎng)基（98%Neurobasal培養(yǎng)基+2%B27+1%青霉素和鏈霉素）。以5μmol/L阿糖胞苷處理細(xì)胞，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖，培養(yǎng)3~5 d后顯微鏡下觀察到存活細(xì)胞即為原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)成功。

2.免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定膽堿能神經(jīng)元 爬片生長的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5 min×3次，4%多聚甲醛于4℃固定30 min，磷酸鹽緩沖液浸泡35 min，滴加山羊抗大鼠ChATⅠ抗（1∶100），4℃過夜，于室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌；滴加兔抗山羊IgGⅡ抗（1∶200），37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌；滴加SABC，室溫下20 min，后磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×4次，蘇木精染色。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野（×400），胞質(zhì)呈棕色的陽性神經(jīng)元即為膽堿能神經(jīng)元。

3.實(shí)驗(yàn)分組與Western blotting法檢測蛋白相對(duì)表達(dá)量 嚴(yán)格無菌條件下將Aβ1~42人工重組蛋白0.10 mg溶解于0.50 mol/L二甲基亞砜（DMSO）溶液中，以磷酸鹽緩沖液（pH值=7.4）稀釋，即為Aβ1~42原液，置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育72 h進(jìn)行老化處理，4℃貯存?zhèn)溆?，以培養(yǎng)細(xì)胞之前用血清稀釋，細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO終濃度不超過0.10%（此濃度不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響）。培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分為對(duì)照組、Aβ1~42組、SN50/SB203580/CTC+Aβ1~42組 和SN50/SB203580/CTC組，培養(yǎng)7 d。對(duì)照組采用等體積磷酸鹽緩沖液和培養(yǎng)基培養(yǎng)；Aβ1~42組采用Aβ1~42（2μmol/L）［4］處理；SN50/SB203580/CTC+Aβ1~42組采用SN50（0.50μmol/L）或SB203580（2μmol/L）或CTC（2μmol/L）進(jìn)行處理，并于30 min后加入Aβ1~42（2μmol/L）；SN50/SB203580/CTC組分別采用SN50（0.50μmol/L）或者SB203580（2μmol/L）或者CTC（2μmol/L）處理，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞行Western blotting檢測。以冰磷酸鹽緩沖液洗掉培養(yǎng)液，按照RIPA裂解液-PMSF蛋白酶抑制劑體積比100∶1配制細(xì)胞裂解液，冰浴裂解細(xì)胞30 min，收集蛋白，于4℃、離心半徑5 cm、10 000 r/min離心10 min，再以BCA法檢測蛋白濃度。取40μg總蛋白上清液行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗大鼠SUR1（1∶500）或兔抗大鼠Kir6.2（1∶500）Ⅰ抗4℃搖動(dòng)封閉一夜。室溫下以0.05%TBST溶液沖洗3次，并與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗在稀釋的TBST溶液（1∶3000）中培養(yǎng)1 h，沖洗。采用ECL發(fā)光液顯色，以GAPDH作為內(nèi)參照物，再采用NIH圖像（1.34版）對(duì)染色后的目的蛋白光密度值（OD值，280 nm）進(jìn)行分析。

4.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用Graphpad Prism 8.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示，呈棕色的陽性神經(jīng)元為膽堿能神經(jīng)元（圖1），占全部培養(yǎng)細(xì)胞＞90%。

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察可見胞質(zhì)呈棕色的膽堿能神經(jīng)元（箭頭所示） 蘇木精染色 ×400Figure 1 Optical microscopy showed the brown cytoplasm of cholinergic neurons(arrow indicates). Hematoxylin staining ×400

不同處理組KATP亞基SUR1蛋白（P=0.000）和Kir6.2蛋白（P=0.000）相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1），其中，SN50+Aβ1~42組和SN50組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組（P=0.010，0.000）和Aβ1~42組（P=0.000，0.000），SN50組亦低于SN50+Aβ1~42組（P=0.012；表2，圖2），表明NF-κB抑制劑SN50可降低Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1蛋白的表達(dá)；SN50+Aβ1~42組和SN50組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P=0.004，0.034）和Aβ1~42組（P=0.000，0.000），而SN50組與SN50+Aβ1~42組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.441；表2，圖3），表明NF-κB抑制劑SN50亦可降低Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基Kir6.2蛋白的表達(dá)。

圖2 Western blotting法顯示，SN50+Aβ1~42組和SN50組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和Aβ1~42組，SN50組亦低于SN50+Aβ1~42組Figure 2 Western blotting showed the expression of KATP subunit SUR1 in SN50+Aβ1-42 group and SN50 group was lower than that in control group and Aβ1-42 group,and the expression of SUR1 protein in SN50 group was lower than that in SN50+Aβ1-42 group.

圖3 Western blotting法顯示，SN50+Aβ1~42組和SN50組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和Aβ1~42組，而SN50組與SN50+Aβ1-42組無明顯差異Figure 3 Western blotting showed the expression of KATP subunit Kir6.2 in SN50+Aβ1-42 group and SN50 group was lower than that in control group and Aβ1-42 group,but there was no significant difference of Kir6.2 between SN50 group and SN50+Aβ1-42 group.

表1 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s，×103）Table 1. Comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups(±s,×10 3)

表1 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s，×103）Table 1. Comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups(±s,×10 3)

Aβ1-42，β-amyloid protein 1-42，β-淀粉樣蛋白1~42

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表2 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的兩兩比較Table 2. Pairwise comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups

不同處理組KATP亞基SUR1蛋白（P=0.000）和Kir6.2蛋白（P=0.000）相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3），其中，SB203580+Aβ1~42組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量僅低于Aβ1~42組（P=0.000），SB203580組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P=0.002）、Aβ1~42組（P=0.000）和Aβ1~42+SB2035800組（P=0.014；表4，圖4），表明p38 MAPK抑制劑SB203580可以降低Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1蛋白的表達(dá)；SB203580+Aβ1~42組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Aβ1~42組（P=0.001），但高于對(duì)照組（P=0.003），SB203580組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P=0.003），Aβ1~42組（P=0.000）和SB203580+Aβ1~42組（P=0.000；表4，圖5），表明p38 MAPK抑制劑SB203580可以影響Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基Kir6.2蛋白的表達(dá)。

圖4 Western blotting法顯示，SB203580+Aβ1~42組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量僅低于Aβ1~42組，SB203580組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組、Aβ1~42組和SB2035800+Aβ1~42組Figure 4 Western blotting showed the expression of KATP subunit SUR1 in SB203580+Aβ1-42 group was lower than that in Aβ1-42 group,the expression of KATP subunit SUR1 protein in SB203580 group was lower than that in control group,Aβ1-42 group and SB203580+Aβ1-42 group.

圖5 Western blotting法顯示，SB203580+Aβ1~42組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Aβ1~42組，但高于對(duì)照組；SB203580組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組、Aβ1~42組和SB203580+Aβ1~42組Figur e 5 Western blotting showed expression of KATP subunit Kir6.2 protein in SB203580+Aβ1-42 group was lower than that in Aβ1-42 group,but higher than that in control group,while expression of KATP subunit Kir6.2 protein in SB203580 group was lower than that in control group,Aβ1-42 group and SB203580+Aβ1-42 group.

表3 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s，×103）Table 3. Comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups(±s,×103)

表3 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s，×103）Table 3. Comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups(±s,×103)

Aβ1-42，β-amyloid protein 1-42，β-淀粉樣蛋白1~42

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表4 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的兩兩比較Table 4. Pairwise comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups

不同處理組KATP亞基SUR1蛋白（P=0.000）和Kir6.2蛋白（P=0.000）相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5），其中，CTC+Aβ1~42組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P=0.040），但低于Aβ1~42組（P=0.000），CTC組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P=0.000）、Aβ1~42組（P=0.000）和CTC+Aβ1~42組（P=0.000；表6，圖6），表明PKC抑制劑CTC可以影響Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1蛋白的表達(dá)；CTC+Aβ1~42組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P=0.000）和Aβ1~42組（P=0.000），CTC組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P=0.001）和Aβ1~42組（P=0.000），但高于CTC+Aβ1~42組（P=0.018；表6，圖7），表明PKC抑制劑CTC可以影響Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基Kir6.2蛋白的表達(dá)。

圖7 Western blotting法顯示，CTC+Aβ1~42組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和Aβ1~42組；CTC組Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和Aβ1~42組，但高于CTC+Aβ1~42組Figur e 7 Western blotting showed the expression of KATP subunit Kir6.2 in CTC+Aβ1-42 group was lower than that in control group and Aβ1-42 group,while the expression of Kir6.2 protein in CTC group was lower than that in control group,Aβ1-42 group,but higher than that in CTC+Aβ1-42 group.

表6 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的兩兩比較Table 6. Pairwise comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups

圖6 Western blotting法顯示，CTC+Aβ1~42組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，但低于Aβ1~42組；CTC組SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組、Aβ1~42組和CTC+Aβ1~42組Figure 6 Western blotting showed the expression of KATP subunit SUR1 in CTC+Aβ1-42 group was higher than in control group,but lower than that in Aβ1-42 group,while the expression of KATP subunit SUR1 in CTC group was lower than that in control group,Aβ1-42 group and CTC+Aβ1-42 group.

表5 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s，×103）Table 5. Comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups(±s,×103)

表5 不同處理組SUR1蛋白和Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s，×103）Table 5. Comparison of SUR1 and Kir6.2 proteins expression in different treatment groups(±s,×103)

Aβ1-42，β-amyloid protein 1-42，β-淀粉樣蛋白1~42

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討 論

Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。有研究顯示，過度氧化應(yīng)激反應(yīng)和自由基毒性作用是阿爾茨海默病的發(fā)生機(jī)制之一［13］。Aβ可以誘發(fā)過度氧化應(yīng)激反應(yīng)，后者打破自由基產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡，加速細(xì)胞凋亡［14］。β修飾細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，增加活性氧（ROS），降低線粒體功能和ATP酶活性，其可導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝以及膜電位失調(diào)，降低細(xì)胞活性［15］。此外，環(huán)孢素A、促紅細(xì)胞生成素以及ATP敏感的鉀離子通道開放劑可能對(duì)β誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用［16-17］。

KATP是一種多蛋白復(fù)合物，由Kir6.1/Kir6.2和SUR1/SUR2不同亞基組成，形成1∶1異質(zhì)八聚體。KATP可通過降低心肌細(xì)胞、神經(jīng)元和其他可興奮細(xì)胞的興奮性，在細(xì)胞膜中發(fā)揮重要作用。在線粒體中，KATP參與線粒體膜電位的調(diào)節(jié)，并調(diào)節(jié)ATP和活性氧的生成［18］。針對(duì)原代培養(yǎng)大鼠膽堿能神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間段（實(shí)驗(yàn)24、48和72小時(shí)）Aβ1~42可誘導(dǎo)KATP亞基表達(dá)的差異性增加，同時(shí)抑制KATP電流。而二氮嗪預(yù)激活線粒體KATP可逆轉(zhuǎn)上述變化［19］；此外，亦有研究顯示，暴露于Aβ1~4224小時(shí)不影響KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)［5，20］。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，Aβ1~42誘導(dǎo)72小時(shí)可顯著增加原代培養(yǎng)神經(jīng)元中KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)，可能是由于Aβ1~42引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)存在，可導(dǎo)致線粒體功能障礙、細(xì)胞代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)ATP下降；鑒于KATP亞基SUR1/Kir6.2對(duì)ATP較為敏感［6］，隨著細(xì)胞內(nèi)ATP下降，KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)量顯著升高。此外，Aβ1~42可通過非特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步刺激KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。KATP亞基SUR1/Kir6.2的活化和表達(dá)升高，可能是防止Aβ1~42細(xì)胞毒性破壞正常細(xì)胞膜電位和自發(fā)電活性而產(chǎn)生的生理反應(yīng)。

NF-κB是一種普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子。活化的NF-κB通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，從而參與疾病的病理生理學(xué)過程［21］。有證據(jù)證明，阿爾茨海默病患者神經(jīng)元內(nèi)NF-κB活性顯著升高［8，22］。Mattson等［23］通過誘導(dǎo)錳超氧化物歧化酶（MnSOD）抑制過氧亞硝基陰離子生成和膜脂質(zhì)過氧化，以探討NF-κB抗凋亡機(jī)制。NF-κB抑制劑SN50是包含41個(gè)氨基酸殘基的肽類，SN50含有穿透細(xì)胞的P50核定位序列，可特異性地阻止NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，從而抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性。本研究SN50+Aβ1~42組KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Aβ1~42組，表明SN50可以降低Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基Kir6.2/SUR1蛋白的表達(dá)。推測其原因，可能是由于SN50通過抑制NF-κB的核移位干擾其生成，從而抑制κB基序的激活以及Aβ1~42生成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，降低Aβ1~42的神經(jīng)毒性作用，間接影響KATP亞基蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，SN50組KATP亞基SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組、Aβ1~42組，表明SN50對(duì)Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1蛋白表達(dá)增加的抑制作用是非特異性的；而SN50組與SN50+Aβ1~42組KATP亞基Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SN50對(duì)Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基Kir6.2蛋白表達(dá)增加的抑制作用具有特異性。因此推測，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分參與KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)。

MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細(xì)胞外信號(hào)如生長因子、有絲分裂原和應(yīng)激細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞存活，而在哺乳動(dòng)物中p38 MAPK即為MAPKs的成員之一［24］。正常情況下，p38 MAPK位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，一旦激活迅速轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，激活活化轉(zhuǎn)錄因子，后者與順式作用元件結(jié)合，引起凋亡相關(guān)基因大量表達(dá)，與細(xì)胞延遲性死亡關(guān)系密切［25］，p38主要依靠促炎性因子、應(yīng)激刺激等激活，此外，還可被脂多糖及革蘭陽性菌細(xì)胞壁成分激活［26-27］。研究表明，Aβ可以刺激培養(yǎng)的細(xì)胞激活p38 MAPK和MAPK激活的蛋白激酶-2（MAPKAP-2），從而上調(diào)炎性因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1）/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生［28-30］。在人類阿爾茨海默病腦組織和轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，激活的p38 MAPK主要定位于神經(jīng)元纖維纏結(jié)、Aβ斑塊和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中［9］。在神經(jīng)變性病中，Aβ過度刺激可導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致周圍神經(jīng)炎癥和神經(jīng)毒性作用［31］及神經(jīng)元凋亡。SB203580是一種吡啶異咪噠唑化合物，是最常用的p38 MAPK特異性抑制劑，主要是作用于p38 MAPK上ATP結(jié)合活性位點(diǎn)T160［32］，通過抑制p38 MAPK與ATP結(jié)合而使其失去激酶活性，從而抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。SB203580通過與p38 MAPK的ATP結(jié)合，較易抑制p38α和p38β的活性。雖然抑制p38 MAPK的自體磷酸化，但上游MAPK磷酸化能力并未受到影響。利用這種化學(xué)性質(zhì)，SB203580已被用于鑒定培養(yǎng)細(xì)胞中p38 MAPK的自磷酸化［33-34］。本研究結(jié)果顯示，與Aβ1~42組相比，SB203580+Aβ1~42組的KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，表明SB203580可以顯著降低Aβ1~42誘導(dǎo)的SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)。分析其原因，可能是由于Aβ斑塊引起其周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生激活，釋放炎性因子，激活p38 MAPK，p38 MAPK迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致KATP亞基SUR1/Kir6.2 mRNA表達(dá)升高，表明活化的p38 MAPK不僅有促神經(jīng)炎癥作用，導(dǎo)致SUR1/Kir6.2 mRNA表達(dá)升高，而且對(duì)周圍神經(jīng)元也有神經(jīng)毒性作用。而SB203580位于ATP結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致p38 MAPK失去與ATP結(jié)合的能力，不僅降低Aβ的細(xì)胞毒性作用，而且顯著降低Aβ1~42誘導(dǎo)的SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)量。因此，p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也參與Aβ1~42細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致的KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)量的升高。在本研究中，SB203580組KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組、Aβ1~42組和SB203580+Aβ1~42組，表明SB203580對(duì)Aβ1~42誘導(dǎo)的Kir6.2蛋白表達(dá)升高的抑制作用是非特異性的，而SB203580+Aβ1~42組與對(duì)照組相比，SUR1蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯差異，表明SB203580對(duì)Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1蛋白表達(dá)升高有特異性抑制作用。因此認(rèn)為，p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分參與Aβ誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)。

PKC是一類依賴磷脂的絲氨酸/蘇氨酸激酶，至少由12種同工酶組成［35］。靜息狀態(tài)下，PKC以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中［36］，而應(yīng)激狀態(tài)下，PKC轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜而被激活。研究表明，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate）是一種非特異性PKC激活劑，可降低神經(jīng)元Aβ水平［37］。PKC調(diào)節(jié)α-分泌酶，尤其是PKC的α同工酶和ε同工酶，PKC介導(dǎo)的α-分泌酶激活在阿爾茨海默病的治療上具有3個(gè)有益結(jié)局：增加可溶性淀粉樣前體蛋白α（sAPPα）產(chǎn)生，減少Aβ，通過PKC介導(dǎo)的下游底物磷酸化增強(qiáng)記憶力［38-39］。本研究采用CTC處理細(xì)胞后，與Aβ1~42組相比，CTC+Aβ1~42組KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，表明CTC可以降低Aβ1~42誘導(dǎo)的SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)。其可能機(jī)制是，PKC從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜的激活促進(jìn)各種蛋白質(zhì)磷酸化，包括離子通道蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基，從而改變KATP通道蛋白的構(gòu)象和門控動(dòng)力學(xué)，升高KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)。PKC抑制劑CTC抑制一系列蛋白磷酸化作用，從而降低KATP亞基蛋白的表達(dá)，以調(diào)節(jié)離子通道的開關(guān)。因此，PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也參與神經(jīng)元KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)的升高。本研究結(jié)果顯示，與Aβ1~42組相比，CTC組KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白表達(dá)均降低，表明CTC對(duì)Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基表達(dá)的抑制作用是非特異性的；與CTC+Aβ1~42組相比，CTC組KATP亞基SUR1蛋白表達(dá)降低，而KATP亞基Kir6.2蛋白則相反，表明CTC對(duì)Aβ1~42誘導(dǎo)的Kir6.2蛋白表達(dá)的抑制作用是特異性的，提示PKC僅部分參與Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基蛋白的表達(dá)。

KATP在阿爾茨海默病中具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。我們的前期研究表明，原代培養(yǎng)的膽堿能神經(jīng)元暴露于Aβ1~4272小時(shí)，導(dǎo)致KATP亞基表達(dá)的差異性增加。在本研究中，NF-κB、p38 MAPK和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均部分參與Aβ1~42誘導(dǎo)的KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)，抑制上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以降低神經(jīng)元KATP亞基SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)。表明NF-κB、p38 MAPK和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Aβ1~42誘導(dǎo)的SUR1/Kir6.2蛋白的表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，為下一步從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面研究防治阿爾茨海默病藥物靶點(diǎn)提供新的理論視角。

利益沖突無