李 兵 侯 晨 何波祥 梁東成連輝明 劉晚傳 汪迎利 黃建雄

（1.廣東省林業(yè)科技推廣總站， 廣東 廣州 510173; 2.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院， 廣東廣州 510520; 3. 信宜市林業(yè)科學研究所，廣東 信宜 525300）

澳洲堅果Macadamia spp. 是山龍眼科Proteaceae 澳洲堅果屬Macadamia 植物，原產于澳大利亞昆士蘭東南和新南威爾士東北部熱帶雨林地區(qū)[1]。澳洲堅果一般由粗殼種（M. tetraphylla L.A.S.Johnson）和光殼種（M. integriforia Maiden& Betche）或者兩個物種的雜交種組成。澳洲堅果果仁含有較高的油份（72%以上），且有較高比例的油酸和棕櫚酸；除較高的油脂含量外，澳洲堅果還含有較高比例的蛋白質和碳水化合物[2]，具豐富的營養(yǎng)和細膩口感，有“堅果之王”的美譽[1,3]。歐美國家對澳洲堅果的選育工作開展得較早，全世界選育澳洲堅果的國家有美國、澳大利亞、新西蘭、南非和巴西等，選育出的澳洲堅果品種超過540 個、且形成較完善的產業(yè)格局[4]。

我國澳洲堅果選育工作起步較晚，開始商業(yè)性引種澳洲堅果僅從上個世紀七十年代開始[5]。前人對澳洲堅果引種、砧木嫁接和空中壓條繁殖等方法做了較多的探索[3,6-7]。例如，何銑揚等[8]從開花、結果、產量和品質多個角度認為品種“849”比“842”更適合在廣西龍州地區(qū)推廣種植。陳顯國等[9]對花穗長度、小花數(shù)量、小花座果率、小花成果率和產量等性狀進行觀察分析，對24 個澳洲堅果品種進行鑒定。種子選育方面，晏敏華等[10]對9 個不同品種澳洲堅果的11 個種子性狀進行分類，劃分為優(yōu)秀、良好及一般3 種類型。楊為海等[11]亦對28 份澳洲堅果種質果實的16 個數(shù)量性狀進行研究，將澳洲堅果種質劃分為4 個不同性狀表現(xiàn)的類群。

盡管前人對澳洲堅果種子形態(tài)和選育方面做了較多的工作，但由于澳洲堅果的種子由堅硬的外殼包裹，其內部結構難以清晰觀測，因此人們對種子內部的結構特征不夠清楚。1967 年Godfery N. Hounsifeld 首次利用多角度X 片收集被攝物體的三維信息，提出了計算機體層攝影術（computed tomography），且發(fā)明了世界上第一臺CT儀[12]。近些年，隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，CT影像的空間分辨率已從厘米數(shù)量級變?yōu)閬單⒚讛?shù)量級，microCT 的空間分辨率已達到1～10 μm[13]。MicroCT 已在醫(yī)學研究方面，如骨骼、牙齒和疾病機制研究有著廣泛的應用[12]，但該技術在林木育種選育方面尚未開展類似的研究工作。本文通過microCT 技術開展了5 個廣東省常見的澳洲堅果品種選育，旨在為我國澳洲堅果種子數(shù)字化選育提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 澳洲堅果材料收集

試驗對象為廣東省信宜市林業(yè)科學研究所種質資源圃內5 個品種：“900”、桂熱一號（GR）、A16、“70”和“695”，選擇5～6 年樹齡、長勢良好且無病害的植株，每個號收集3 個種子，共15個種子。

1.2 澳洲堅果基本特征測量

利用游標卡尺分別測量澳洲堅果5 個品種果實直徑、果皮厚度、堅果直徑和種殼厚度。

1.3 MicroCT 設置和參數(shù)

MicroCT 掃描檢測在平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司中完成。利用MicroCT（設備型號為VNC-102）對澳洲堅果多角度進行掃描。將澳洲堅果樣本置于X 射線源和CCD 照相機之間，掃描過程中沿垂直長軸做180°旋轉并保持在掃描區(qū)域內，根據(jù)不同品種澳洲堅果種子大小差異，進行200-400 次投射，由CCD 找攝像機捕獲圖像并傳輸?shù)桨惭b有圖像處理軟件的計算機中。整個掃描時間為3 400-5 000 ms。利用UG 和Mimics 軟件逆向構建三維斷面像，重建類型是迭代，重建尺寸為0.048×0.048×0.08 mm，維數(shù)1 024×1 024×560。

1.4 測量數(shù)據(jù)整理和聚類分析

利用Avatar 軟件首先將數(shù)據(jù)轉化為橫向斷層數(shù)據(jù)，每兩個單位建立一層橫向斷層圖像，間隔40 μm，然后重新構建澳洲堅果3D 圖像?；?D圖像分別測量5 個澳洲堅果品種種子體積、種殼體積、種仁體積和種殼內的空隙率，即空隙體積/整個種子體積。以上獲得了澳洲堅果基本特征和micro CT 分析參數(shù)各4 個，對每個參數(shù)值取log 10后做后續(xù)分析，然后對5 個品種8 個性狀進行NJ聚類分析。此外，利用Excel 軟件對澳洲堅果的基本特征和microCT 掃描后的果實特征進行T 檢驗，設置參數(shù)為單尾且滿足雙樣本方差假設。

2 結果與分析

研究結果表明“900”果實直徑和堅果直徑皆最大，而“695”的果實直徑和堅果直徑最?。▓D1)。此外，A16 具有最厚的果皮和種殼，“695”的種殼最薄，“695”和GR 屬于種皮皆較薄，但T檢驗結果表明兩者無顯著性差異（P= 0.062）。

通過microCT 掃描數(shù)據(jù)結果表明澳洲堅果果實的外形近似一個球體（圖2a 和圖2b)，但果實內部的種仁近似一個圓錐體（圖2b 和圖2c)。澳洲堅果果實除具有果皮、種殼和種仁外，在種殼內部還有空隙（圖2c 和圖2d)。

圖2 利用microCT 技術掃描后圖像重建澳洲堅果果實的形態(tài)Fig. 2 The morphology of a Macadamia spp. fruit was reconstructed using microCT scanning technique

從外皮結構來看，“900”和“695”的果皮比較粗糙，A16 次之，GR 和“70”的果皮比較光滑（圖3）。“900”果實下端有銳尖的突起，A16、“70”和“695”果實下端有突起但較鈍，而GR 的突起不明顯。MicroCT 掃描5 個品種的澳洲堅果果實后發(fā)現(xiàn)“900”、GR、A16 和“70”都有較明顯的外殼結構，而“695”的外殼不明顯（圖3）。此外，GR、A16 和“70”的種仁形狀較扁，朝下一端有叫明顯的突出尖頭，而“900”和“695”的種仁形態(tài)較圓，朝下一端的突起較鈍。

利用microCT 掃描技術測出“900”的果實最大，A16 和“70”次之，GR 和“695” 果實的體積最小（圖4）。測得“900”的種子最大，GR 次之，A16 和“70”再次，“695”最小”。此外，“900”和A16 的種仁最大，GR 和“70”次之，“695”的種仁最小。此外，A16、“70”和“695”種子的空隙率較大，而“900”和GR 的孔隙率較小。

圖3 MicroCT 掃描后不同品種澳洲堅果果實3D 多彩半透明展示Fig. 3 3D colorful translucent display of various Macadamia spp. varieties using microCT

最后，利用以上獲得的澳洲堅果果實形態(tài)數(shù)據(jù)構建性狀矩陣，然后利用log10 處理后進行聚類分析（圖5）。結果發(fā)現(xiàn)“900”的性狀特征與其它4 個澳洲堅果品種差異最大，其次差異較大的品種是“695”，剩下的3 個品種中GR 和“70”在形態(tài)上較相近，兩者皆與A16 有較大差別。

3 結論與討論

圖4 MicroCT 掃描不同澳洲堅果品種果實與種子性狀的比較Fig. 4 Comparison of fruit characters of Macadamia spp. varieties using microCT

圖5 8 個澳洲堅果果實性狀聚類分析結果Fig. 5 The results of cluster analysis based on eight characters of Macadamia spp.

我國澳洲堅果良種主要來源于國外引種和本土培育。本研究中“695”和A16 引種于澳大利亞，“900”和“70”引種于美國夏威夷[14]，而桂熱一號是廣西亞熱帶作物研究所通過引種“8”后選育出來的新品種[15]。聚類分析研究結果表明“900”、“695”和A16 的形態(tài)特征與桂熱一號（GR）和“70”的種子差異較明顯。該結果與賀熙勇等[14]的研究結果一致，后者研究表明“900”和“695”屬于第I 亞類，即粗殼種與光殼種混種的后代。而A16 屬于第II 亞類，雖然其亦為粗殼種與光殼種混種的后代，但更偏向于光殼種。桂熱一號和“70”為光殼種，所以屬于第III 亞類。

通過常規(guī)測量和MicroCT 掃描數(shù)據(jù)比較，我們發(fā)現(xiàn)“900”品種在5 個品種種子中脫穎而出，即具有體積最大的果實和種仁，種子內部空隙率最低。此外，由于桂熱一號種子具有較薄的果皮和種殼、體積較大的種仁和較小的種內空隙率等特征，因此亦為較優(yōu)質的澳洲品種。相比之下，A16 的種仁亦較大，但果皮和種殼較厚且種內空隙率較高，食用和工業(yè)加工方面受局限?！?0”和“695”的種殼厚度均較薄且種內空隙率接近，但前者果實體積和種仁體積皆較大，因此“70”整體上優(yōu)于“695”。

基于以上比較，我們認為5 個品種從優(yōu)到劣的排序為“900”、桂熱一號、A16、“70”和“695”。綜上，本研究為首次應用microCT 技術對植物堅果進行掃描和形態(tài)構建，其諸多功能（如體積估計和空隙率計算）對澳洲堅果的選育和優(yōu)劣鑒別起到重要的作用。