李 兵 侯 晨 何波祥 梁東成連輝明 劉晚傳 汪迎利 黃建雄

（1.廣東省林業(yè)科技推廣總站， 廣東 廣州 510173; 2.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院， 廣東廣州 510520; 3. 信宜市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東 信宜 525300）

澳洲堅(jiān)果Macadamia spp. 是山龍眼科Proteaceae 澳洲堅(jiān)果屬M(fèi)acadamia 植物，原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭東南和新南威爾士東北部熱帶雨林地區(qū)[1]。澳洲堅(jiān)果一般由粗殼種（M. tetraphylla L.A.S.Johnson）和光殼種（M. integriforia Maiden& Betche）或者兩個(gè)物種的雜交種組成。澳洲堅(jiān)果果仁含有較高的油份（72%以上），且有較高比例的油酸和棕櫚酸；除較高的油脂含量外，澳洲堅(jiān)果還含有較高比例的蛋白質(zhì)和碳水化合物[2]，具豐富的營(yíng)養(yǎng)和細(xì)膩口感，有“堅(jiān)果之王”的美譽(yù)[1,3]。歐美國(guó)家對(duì)澳洲堅(jiān)果的選育工作開展得較早，全世界選育澳洲堅(jiān)果的國(guó)家有美國(guó)、澳大利亞、新西蘭、南非和巴西等，選育出的澳洲堅(jiān)果品種超過540 個(gè)、且形成較完善的產(chǎn)業(yè)格局[4]。

我國(guó)澳洲堅(jiān)果選育工作起步較晚，開始商業(yè)性引種澳洲堅(jiān)果僅從上個(gè)世紀(jì)七十年代開始[5]。前人對(duì)澳洲堅(jiān)果引種、砧木嫁接和空中壓條繁殖等方法做了較多的探索[3,6-7]。例如，何銑揚(yáng)等[8]從開花、結(jié)果、產(chǎn)量和品質(zhì)多個(gè)角度認(rèn)為品種“849”比“842”更適合在廣西龍州地區(qū)推廣種植。陳顯國(guó)等[9]對(duì)花穗長(zhǎng)度、小花數(shù)量、小花座果率、小花成果率和產(chǎn)量等性狀進(jìn)行觀察分析，對(duì)24 個(gè)澳洲堅(jiān)果品種進(jìn)行鑒定。種子選育方面，晏敏華等[10]對(duì)9 個(gè)不同品種澳洲堅(jiān)果的11 個(gè)種子性狀進(jìn)行分類，劃分為優(yōu)秀、良好及一般3 種類型。楊為海等[11]亦對(duì)28 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)果實(shí)的16 個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行研究，將澳洲堅(jiān)果種質(zhì)劃分為4 個(gè)不同性狀表現(xiàn)的類群。

盡管前人對(duì)澳洲堅(jiān)果種子形態(tài)和選育方面做了較多的工作，但由于澳洲堅(jiān)果的種子由堅(jiān)硬的外殼包裹，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以清晰觀測(cè)，因此人們對(duì)種子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特征不夠清楚。1967 年Godfery N. Hounsifeld 首次利用多角度X 片收集被攝物體的三維信息，提出了計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)（computed tomography），且發(fā)明了世界上第一臺(tái)CT儀[12]。近些年，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，CT影像的空間分辨率已從厘米數(shù)量級(jí)變?yōu)閬單⒚讛?shù)量級(jí)，microCT 的空間分辨率已達(dá)到1～10 μm[13]。MicroCT 已在醫(yī)學(xué)研究方面，如骨骼、牙齒和疾病機(jī)制研究有著廣泛的應(yīng)用[12]，但該技術(shù)在林木育種選育方面尚未開展類似的研究工作。本文通過microCT 技術(shù)開展了5 個(gè)廣東省常見的澳洲堅(jiān)果品種選育，旨在為我國(guó)澳洲堅(jiān)果種子數(shù)字化選育提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 澳洲堅(jiān)果材料收集

試驗(yàn)對(duì)象為廣東省信宜市林業(yè)科學(xué)研究所種質(zhì)資源圃內(nèi)5 個(gè)品種：“900”、桂熱一號(hào)（GR）、A16、“70”和“695”，選擇5～6 年樹齡、長(zhǎng)勢(shì)良好且無病害的植株，每個(gè)號(hào)收集3 個(gè)種子，共15個(gè)種子。

1.2 澳洲堅(jiān)果基本特征測(cè)量

利用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量澳洲堅(jiān)果5 個(gè)品種果實(shí)直徑、果皮厚度、堅(jiān)果直徑和種殼厚度。

1.3 MicroCT 設(shè)置和參數(shù)

MicroCT 掃描檢測(cè)在平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司中完成。利用MicroCT（設(shè)備型號(hào)為VNC-102）對(duì)澳洲堅(jiān)果多角度進(jìn)行掃描。將澳洲堅(jiān)果樣本置于X 射線源和CCD 照相機(jī)之間，掃描過程中沿垂直長(zhǎng)軸做180°旋轉(zhuǎn)并保持在掃描區(qū)域內(nèi)，根據(jù)不同品種澳洲堅(jiān)果種子大小差異，進(jìn)行200-400 次投射，由CCD 找攝像機(jī)捕獲圖像并傳輸?shù)桨惭b有圖像處理軟件的計(jì)算機(jī)中。整個(gè)掃描時(shí)間為3 400-5 000 ms。利用UG 和Mimics 軟件逆向構(gòu)建三維斷面像，重建類型是迭代，重建尺寸為0.048×0.048×0.08 mm，維數(shù)1 024×1 024×560。

1.4 測(cè)量數(shù)據(jù)整理和聚類分析

利用Avatar 軟件首先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為橫向斷層數(shù)據(jù)，每?jī)蓚€(gè)單位建立一層橫向斷層圖像，間隔40 μm，然后重新構(gòu)建澳洲堅(jiān)果3D 圖像?；?D圖像分別測(cè)量5 個(gè)澳洲堅(jiān)果品種種子體積、種殼體積、種仁體積和種殼內(nèi)的空隙率，即空隙體積/整個(gè)種子體積。以上獲得了澳洲堅(jiān)果基本特征和micro CT 分析參數(shù)各4 個(gè)，對(duì)每個(gè)參數(shù)值取log 10后做后續(xù)分析，然后對(duì)5 個(gè)品種8 個(gè)性狀進(jìn)行NJ聚類分析。此外，利用Excel 軟件對(duì)澳洲堅(jiān)果的基本特征和microCT 掃描后的果實(shí)特征進(jìn)行T 檢驗(yàn)，設(shè)置參數(shù)為單尾且滿足雙樣本方差假設(shè)。

2 結(jié)果與分析

研究結(jié)果表明“900”果實(shí)直徑和堅(jiān)果直徑皆最大，而“695”的果實(shí)直徑和堅(jiān)果直徑最?。▓D1)。此外，A16 具有最厚的果皮和種殼，“695”的種殼最薄，“695”和GR 屬于種皮皆較薄，但T檢驗(yàn)結(jié)果表明兩者無顯著性差異（P= 0.062）。

通過microCT 掃描數(shù)據(jù)結(jié)果表明澳洲堅(jiān)果果實(shí)的外形近似一個(gè)球體（圖2a 和圖2b)，但果實(shí)內(nèi)部的種仁近似一個(gè)圓錐體（圖2b 和圖2c)。澳洲堅(jiān)果果實(shí)除具有果皮、種殼和種仁外，在種殼內(nèi)部還有空隙（圖2c 和圖2d)。

圖2 利用microCT 技術(shù)掃描后圖像重建澳洲堅(jiān)果果實(shí)的形態(tài)Fig. 2 The morphology of a Macadamia spp. fruit was reconstructed using microCT scanning technique

從外皮結(jié)構(gòu)來看，“900”和“695”的果皮比較粗糙，A16 次之，GR 和“70”的果皮比較光滑（圖3）?！?00”果實(shí)下端有銳尖的突起，A16、“70”和“695”果實(shí)下端有突起但較鈍，而GR 的突起不明顯。MicroCT 掃描5 個(gè)品種的澳洲堅(jiān)果果實(shí)后發(fā)現(xiàn)“900”、GR、A16 和“70”都有較明顯的外殼結(jié)構(gòu)，而“695”的外殼不明顯（圖3）。此外，GR、A16 和“70”的種仁形狀較扁，朝下一端有叫明顯的突出尖頭，而“900”和“695”的種仁形態(tài)較圓，朝下一端的突起較鈍。

利用microCT 掃描技術(shù)測(cè)出“900”的果實(shí)最大，A16 和“70”次之，GR 和“695” 果實(shí)的體積最?。▓D4）。測(cè)得“900”的種子最大，GR 次之，A16 和“70”再次，“695”最小”。此外，“900”和A16 的種仁最大，GR 和“70”次之，“695”的種仁最小。此外，A16、“70”和“695”種子的空隙率較大，而“900”和GR 的孔隙率較小。

圖3 MicroCT 掃描后不同品種澳洲堅(jiān)果果實(shí)3D 多彩半透明展示Fig. 3 3D colorful translucent display of various Macadamia spp. varieties using microCT

最后，利用以上獲得的澳洲堅(jiān)果果實(shí)形態(tài)數(shù)據(jù)構(gòu)建性狀矩陣，然后利用log10 處理后進(jìn)行聚類分析（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)“900”的性狀特征與其它4 個(gè)澳洲堅(jiān)果品種差異最大，其次差異較大的品種是“695”，剩下的3 個(gè)品種中GR 和“70”在形態(tài)上較相近，兩者皆與A16 有較大差別。

3 結(jié)論與討論

圖4 MicroCT 掃描不同澳洲堅(jiān)果品種果實(shí)與種子性狀的比較Fig. 4 Comparison of fruit characters of Macadamia spp. varieties using microCT

圖5 8 個(gè)澳洲堅(jiān)果果實(shí)性狀聚類分析結(jié)果Fig. 5 The results of cluster analysis based on eight characters of Macadamia spp.

我國(guó)澳洲堅(jiān)果良種主要來源于國(guó)外引種和本土培育。本研究中“695”和A16 引種于澳大利亞，“900”和“70”引種于美國(guó)夏威夷[14]，而桂熱一號(hào)是廣西亞熱帶作物研究所通過引種“8”后選育出來的新品種[15]。聚類分析研究結(jié)果表明“900”、“695”和A16 的形態(tài)特征與桂熱一號(hào)（GR）和“70”的種子差異較明顯。該結(jié)果與賀熙勇等[14]的研究結(jié)果一致，后者研究表明“900”和“695”屬于第I 亞類，即粗殼種與光殼種混種的后代。而A16 屬于第II 亞類，雖然其亦為粗殼種與光殼種混種的后代，但更偏向于光殼種。桂熱一號(hào)和“70”為光殼種，所以屬于第III 亞類。

通過常規(guī)測(cè)量和MicroCT 掃描數(shù)據(jù)比較，我們發(fā)現(xiàn)“900”品種在5 個(gè)品種種子中脫穎而出，即具有體積最大的果實(shí)和種仁，種子內(nèi)部空隙率最低。此外，由于桂熱一號(hào)種子具有較薄的果皮和種殼、體積較大的種仁和較小的種內(nèi)空隙率等特征，因此亦為較優(yōu)質(zhì)的澳洲品種。相比之下，A16 的種仁亦較大，但果皮和種殼較厚且種內(nèi)空隙率較高，食用和工業(yè)加工方面受局限?！?0”和“695”的種殼厚度均較薄且種內(nèi)空隙率接近，但前者果實(shí)體積和種仁體積皆較大，因此“70”整體上優(yōu)于“695”。

基于以上比較，我們認(rèn)為5 個(gè)品種從優(yōu)到劣的排序?yàn)椤?00”、桂熱一號(hào)、A16、“70”和“695”。綜上，本研究為首次應(yīng)用microCT 技術(shù)對(duì)植物堅(jiān)果進(jìn)行掃描和形態(tài)構(gòu)建，其諸多功能（如體積估計(jì)和空隙率計(jì)算）對(duì)澳洲堅(jiān)果的選育和優(yōu)劣鑒別起到重要的作用。