任飛艷， 陳 顯， 王士泉

(熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， ?？?571158)

卵葉海桑(SonneratiaovataBacker)隸屬于海?？坪Ｉ伲L于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶，主要分布于泰國、越南、馬來西亞、印度尼西亞以及巴布亞新幾內(nèi)亞等地[1-3]。我國僅天然分布于海南省文昌市清瀾港自然保護(hù)區(qū)，分布范圍狹窄，天然更新困難，被列為瀕危物種[2,4]。目前國內(nèi)外對卵葉海桑的研究較少，主要集中在化學(xué)成分[5-7]、遺傳多樣性[8-9]、染色體核型[10-11]、育苗技術(shù)[12]、形態(tài)解剖[13-16]等方面。卵葉海桑具有抗風(fēng)、耐貧瘠、耐鹽堿等特點(diǎn)，是理想的海防林樹種。

卵葉海桑生長地在人為因素和自然因素的共同作用下，生態(tài)系統(tǒng)日漸脆弱，抵御外界干擾的能力降低，自然更新相對困難，個體數(shù)量也在不斷減少。前期調(diào)查表明，在卵葉海桑林下無幼苗生長。卵葉海桑通過種子繁殖，但在自然條件下，種子發(fā)芽率極低，影響了其自然更新。研究表明，擬海桑的花粉敗育率為95.62%，海南海桑為54.43%，這會影響開花時期的有效傳粉和授粉過程，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率低和種子量少[17]。本文以卵葉海?；ǚ蹫閷?shí)驗(yàn)材料，利用TTC染色法、MTT染色法、亞歷山大染色法、I2-KI染色法、紅墨水染色法和離體萌發(fā)法，測定卵葉海桑的花粉活力，確定卵葉海桑花粉活力快速有效的測定方法，為下一步探討卵葉海桑瀕危的原因，進(jìn)行傳粉、繁育系統(tǒng)研究和雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

卵葉海桑是常綠喬木，高4～8 m?；ㄐ蝽斏?～3朵，無花瓣，萼管表面具明顯的小瘤狀突起，花萼片內(nèi)面紅色。2019年3—6月，在海南省文昌市清瀾港自然保護(hù)區(qū)，選取初花期未散粉的花朵，待花藥裂開，花粉自然散出后，采用6種不同的方法測定花粉活力。

1.2 方 法

1.2.1TTC染色法[18]

用鑷子取花粉散落到試管里，滴1～2滴0.5%的TTC染液，攪拌均勻后，置于37 ℃恒溫箱中，避光染色2～3 h。將玻片置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)有活力和無活力的花粉數(shù)。具有活力的花粉被染色后呈紅色，發(fā)育不良活力弱的花粉無法著色。

1.2.2MTT染色法[19]

用鑷子將花粉置于載玻片上，滴1～2滴5%的MTT染液染色(MTT有致癌性，使用過程應(yīng)佩戴手套)，置于25 ℃恒溫箱中，避光染色1～2 h。然后將玻片置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)有活力和無活力的花粉數(shù)。凡是具有活力的花粉被染色后呈藍(lán)紫色，發(fā)育不良生活力弱的花粉呈黃褐色。

1.2.3亞歷山大染色法[20]

用鑷子將花粉置于載玻片上，滴1～2滴亞歷山大染液染色，蓋上蓋玻片，室溫染色，將玻片置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)有活力和無活力的花粉數(shù)。凡是具有活力的花粉，原生質(zhì)呈紅色，花粉壁呈綠色；原生質(zhì)和花粉壁均呈綠色則為發(fā)育不良或無活力。

1.2.4I2-KI染色法[21]

區(qū)總館要充分發(fā)揮示范引導(dǎo)作用，圍繞基本文化服務(wù)功能，精心設(shè)置服務(wù)項(xiàng)目，提高全區(qū)各類圖書館、公共閱讀空間的利用率。各分館、基層館外服務(wù)點(diǎn)，作為強(qiáng)力支撐，以標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)為抓手，實(shí)現(xiàn)服務(wù)供給全覆蓋，社會參與覆蓋，志愿者服務(wù)推進(jìn)，科技文化傳播，接軌一流標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)。

用鑷子將花粉置于載玻片上，加1～2滴I2-KI染液，蓋上蓋玻片，室溫染色，將玻片置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)有活力和無活力的花粉數(shù)。凡具有生活力的花粉粒被染色后呈藍(lán)黑色(其中含有積累的淀粉)，發(fā)育不良或無活力的花粉粒呈黃褐色。

1.2.5紅墨水染色法[22]

用鑷子將花粉置于載玻片上，加1～2滴紅墨水染液，蓋上蓋玻片，室溫染色，將玻片置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)有活力和無活力的花粉數(shù)。凡是具有活力的花粉呈無色，發(fā)育不良活力弱的花粉呈紅色。

1.2.6離體萌發(fā)法[23-24]

用鑷子將花粉置于雙凹載玻片上，加1～2滴蔗糖-硼酸培養(yǎng)液(10%蔗糖，10 mg·L-1硼酸，0.5%瓊脂)，將載玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上蓋玻片，置于25 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)后將玻片置于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)有生活力和無生活力的花粉數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每株設(shè)3次重復(fù)，每次取10余個視野觀察。每個個體統(tǒng)計(jì)的花粉數(shù)都在500粒以上。采用Excel 2007軟件和SPSS 19.0分析軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較分析。在USB數(shù)碼顯微鏡下放大40×或10×拍照保存并處理圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色法測定花粉活力

TTC是一種無色的氧化還原染料，氧化狀態(tài)下是無色的。具有活力的花粉呼吸作用強(qiáng)烈，脫氫酶能將無色的TTC還原為紅色的TTF。沒有活力的花粉不具有上述功能。有活力的花粉被染成紅色，而無活力的花粉不能著紅色(圖1 A)。TTC染色法多次實(shí)驗(yàn)未果，花粉活力均為0，表明TTC染色法不適合用來測定卵葉海桑的花粉活力(表1)。

2.2 MTT染色法測定花粉活力

MTT是一種能接受氫原子的染料，外源性的MTT還原生成難溶性并沉淀的藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)，而死細(xì)胞沒有此功能。MTT染色法根據(jù)花粉粒中脫氫酶的活性確定花粉生活力，凡被染成藍(lán)紫色的為活力較強(qiáng)的花粉，呈黃褐色為發(fā)育不良的花粉，無色為無活力的花粉(圖1 B)。MTT染色法測定的卵葉海?；ǚ刍盍?8.00%～90.40%，平均為89.30%(表1)。

表1 不同方法測定的花粉活力Table 1 Pollen viability measured by different methods

2.3 亞歷山大染色法測定花粉活力

2.4 I2-KI染色法測定花粉活力

利用I2-KI溶液對花粉粒進(jìn)行染色，淀粉遇碘后變成藍(lán)色，花粉粒中淀粉含量直接影響花粉的著色程度，并成為判斷花粉活力高低的依據(jù)。有活力的花粉淀粉含量高，被染成藍(lán)色，而無活力的花粉淀粉含量少，呈黃褐色(圖1 D)。 I2-KI染色法測定的結(jié)果為83.20%～92.60%，平均為89.35%(表1)。

2.5 紅墨水染色法測定花粉活力

利用紅墨水對花粉粒進(jìn)行染色，有活力的花粉其細(xì)胞膜具有選擇透性，無活力的花粉具有完全滲透性，因此未被染色的花粉粒是具有生活力的，呈紅色的為發(fā)育不良活力弱的花粉(圖1 E)。紅墨水染色法測定的結(jié)果為79.40%～87.00%，平均為83.22%(表1)。

2.6 離體萌發(fā)法測定花粉活力

卵葉海桑的花粉粒為橢圓形，未萌發(fā)時呈黃色，在25 ℃避光培養(yǎng)30 min后，有活力的花粉粒開始出現(xiàn)透明突起，隨后在2～3 h期間逐漸伸長形成花粉管(圖1 F)。以花粉管的長度大于花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)狀況，計(jì)算出花粉活力。離體萌發(fā)法測得的萌發(fā)率為81.20%～93.40%, 平均值89.11%(表1)。

2.7 不同測定方法花粉活力的比較

紅墨水染色法的結(jié)果低于離體萌發(fā)法，二者在5%水平上差異顯著(p<0.05)，在1%水平上差異極顯著(p<0.01)。MTT染色法和I2-KI染色法的結(jié)果略高于離體萌發(fā)法，亞歷山大染色法的結(jié)果略低于離體萌發(fā)法，三者與離體萌發(fā)法的結(jié)果在5%水平和1%水平上差異均不顯著(表2)。

表2 5種方法測定的卵葉海?；ǚ刍盍Ρ容^Table 2 Comparison of pollen viability of S. ovata measured by 5 methods

而TTC染色法的花粉活力均為0，多次實(shí)驗(yàn)未果，故在此不進(jìn)行比較分析。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用離體萌發(fā)法測得的花粉活力較高。對于培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)成分、pH值要求較高，花費(fèi)時間長，不太適合快速準(zhǔn)確地測定花粉活力，但可將該方法作為標(biāo)準(zhǔn)，確定哪種方法更適合卵葉海桑花粉活力的測定。

TTC染色法已廣泛用于許多植物花粉活力的測定，但其對花粉要求較高，當(dāng)花粉中脫氫輔酶含量較低時，就難以準(zhǔn)確地測定花粉活力[25]。本實(shí)驗(yàn)中，TTC染色法對卵葉海?；ǚ鄣娜旧Ч患?，可能與材料選擇有關(guān)，花粉均呈淡紅色，顏色深淺差異不明顯，很難區(qū)分其是否被染色，TTC無法成功染色的原因有待進(jìn)一步研究。MTT染色法操作要求較高，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，且需要在避光環(huán)境下進(jìn)行操作，所以MTT不適合快速準(zhǔn)確測定花粉活力。紅墨水染色法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，時間也較短，適于野外測定，但隨時間的延長多數(shù)花粉逐漸失去選擇透性，如不及時統(tǒng)計(jì)可能會降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。亞歷山大染色法染色效果較好，在室溫下放置一段時間就可以觀察結(jié)果且易辨別，適用于野外條件下花粉活力的快速測定，結(jié)果也比較接近離體萌發(fā)法。I2-KI染色法主要是依據(jù)花粉粒內(nèi)的淀粉判斷花粉活力，決定性因素是淀粉含量的高低，主要適用于玉米、小麥等淀粉含量比較高的農(nóng)作物花粉活力測定[26]。從本實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果看，I2-KI染色法所測得的花粉活力最高，接近于離體萌發(fā)法的結(jié)果。I2-KI染色法是一種經(jīng)濟(jì)、快速測定花粉活力的方法，適合野外條件下花粉活力的檢測。

綜上所述，I2-KI染色法和亞歷山大染色法都可以快速、準(zhǔn)確地檢測出卵葉海桑的花粉是否有活力以及活力的高低，是判斷花粉活力的簡便準(zhǔn)確方法，可為傳粉、繁育系統(tǒng)研究和雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。