程璐 關玉華 時學昆 周志強 姜少燕

心力衰竭(心衰)為復雜、多因素疾病，為多種心臟疾病發(fā)展的終末階段，以心臟收縮、舒張障礙為主要病理特點，在老年群體中高發(fā)，且住院率、死亡率極高，對病人生命安全及正常生活影響巨大。心衰的診斷與治療受到社會的廣泛關注。microRNA是由22～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，參與機體細胞增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等多種生理病理過程，在心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。microRNA 499具有敏感的心肌特異性，極有可能成為心衰診斷的生物標志物，受到了研究者的注意[2]。本研究檢測了老年心衰病人血清microRNA 499的表達水平，分析其與N末端B型利鈉肽原(N terminal pro B type natriuretic peptide，NT-proBNP)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的關系，以期探討血清microRNA 499在老年心衰診斷中的臨床價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年1月至2019年7月我院老年心血管科收治的45例老年心衰病人作為老年心衰組；病人均符合心衰的診斷標準[3]，年齡≥60歲。排除標準：(1)合并腎病綜合征、肺源性心臟病、先天性心臟病、糖尿病或血糖控制不佳、嚴重心律失常、風濕性心臟瓣膜病、擴張型和肥厚型心肌病的病人；(2)惡性腫瘤、急慢性感染病人；(3)自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腦血管疾病病人；(4)近3個月內(nèi)有心肌梗死史者。其中男23例，女22例；年齡60～90歲，平均(72.5±5.6)歲；NYHA分級Ⅱ級21例，Ⅲ級16例，Ⅳ級8例。選取同期30例老年健康體檢者為健康對照組，其中男15例，女15例；年齡60～88歲，平均(72.1±5.3)歲。2組病人性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準，所有研究對象及其家屬均自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Hcy、NT-proBNP檢測：收集2組清晨空腹靜脈血3 mL，分別置于含有EDTA抗凝劑的紅色采血管內(nèi)，4000 r/min離心5 min后，分離血清，借助全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特AU5800)及其配套試劑盒檢測Hcy水平，采用電化學發(fā)光免疫分析儀(羅氏COBASe 601)及其配套試劑盒檢測NT-proBNP水平，操作步驟均嚴格參照說明書。

1.2.2 microRNA 499表達水平檢測：采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測microRNA 499在血清中的表達量。取待測定的血清，加入Trizol提取血液中的總RNA，用超微量分光光度計檢測其純度，計算RNA濃度；而后借助TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用cDNA進行實時熒光定量PCR，反應條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；共45個循環(huán)。采用hs-nRNA U6(HmiRQP9001，GeneCopoeia)作為內(nèi)參進行校正和標準化。用2-ΔΔCq法計算血清中microRNA 499的相對表達量，重復3次，取平均值。microRNA 499 正向引物序列：5′-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3′；microRNA 499反向引物：5′-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3′；U6內(nèi)參正向引物：5′- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；U6內(nèi)參反向引物：5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 結果

2.1 2組microRNA 499、Hcy、NT-proBNP水平比較 老年心衰組血清中microRNA 499表達水平、Hcy、NT-proBNP水平均明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組microRNA 499、Hcy、NT-proBNP的水平比較

2.2 心衰病人microRNA 499與Hcy、NT-proBNP水平的相關性 相關性分析結果顯示，血清microRNA 499表達水平與Hcy、NT-proBNP水平呈正相關。

2.3 microRNA 499在心衰中的診斷價值 繪制ROC曲線后發(fā)現(xiàn)，microRNA 499診斷心衰的AUC為0.950，截斷點為0.867，靈敏度為0.867，特異性為1。

3 討論

microRNA能通過與真核細胞靶基因mRNA上的mRNA 3′-UTR互補配對來降低mRNA分子的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)機體細胞的產(chǎn)生、增殖以及分化、凋亡等病理生理過程，參與心肌細胞的增生、纖維化以及細胞外環(huán)境改變等[4]。microRNA 499在心衰診斷方面具有較明確的心肌特異性、敏感性，且其不受病人年齡、性別、腎功能、血脂水平等的影響，穩(wěn)定性高，引起心衰研究人員的高度重視[5-6]。

目前臨床上對心衰的診斷評估除了體格檢查、多種輔助檢測外，結合NT-proBNP、Hcy等生物活性指標來判斷心衰病人疾病進展的方式受到研究人員的肯定。但NT-proBNP、Hcy等生物活性指標以蛋白質(zhì)為基礎，且其蛋白質(zhì)成分比較復雜，具有多樣性，故而在含量較低的樣本中敏感性難以保證，診斷價值受限[7]。本研究結果顯示，老年心衰病人血清中microRNA 499、Hcy、NT-proBNP表達水平明顯高于健康對照組，提示老年心衰病人血清microRNA 499的表達水平明顯升高，可作為心衰的輔助診斷指標。由于microRNA 499為心肌特異性microRNA，在心肌細胞缺血損傷時，細胞內(nèi)的microRNA 499會過度釋放至血液中[8]。另外，本研究還分析了老年心衰病人microRNA 499表達水平與NT-proBNP、Hcy水平的關系，結果發(fā)現(xiàn)，血清microRNA 499表達水平與Hcy、NT-proBNP水平均呈正相關，提示microRNA 499可能與Hcy、NT-proBNP指標一樣，可作為心衰治療及預后的輔助判斷標志物。此外，ROC曲線結果顯示：microRNA 499診斷老年心衰的ROC曲線的AUC為0.950，靈敏度為0.867，特異度為1，證明microRNA 499在心衰中的診斷價值較高，可以作為心衰的輔助診斷指標，可為心衰的診斷提供可靠參考。

綜上所述，microRNA 499在老年心衰病人血清中的水平明顯升高，與Hcy、NT-proBNP水平均呈正相關，在心衰中的診斷價值較可靠。