劉匯洋，劉軒綺，白靜茹，趙京洋，尹芳蕊，王永福

(1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rhreumatoid Athritis，RA)是一種慢性全身性炎癥性自身免疫性疾病，主要特征為滑膜組織內(nèi)有大量浸潤的炎性免疫細胞，并釋放細胞因子及趨化因子，導(dǎo)致持續(xù)的滑膜炎癥，增強軟骨細胞分解代謝和破骨細胞生成，最終導(dǎo)致骨侵蝕、骨破壞[1]。目前的研究證實炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、JAK/STAT途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細胞因子以及共刺激信號途徑(包括APC表面的B7家族分子以及T細胞表面的CD28/CTLA-4分子)等在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。通過對RA的發(fā)病機制研究的積累，人們發(fā)現(xiàn)抑制相關(guān)炎癥因子的表達以及通路激活可以為RA的治療提供新的思路。在早期研究中，內(nèi)皮細胞蛋白C受體(Endothelial protein C receptor，EPCR)是內(nèi)皮細胞的特異性跨膜蛋白，能與蛋白C(Protein C，PC)、活化蛋白C(Activated protein C，APC)，凝血因子VIIa(factor VIIa，F(xiàn)VIIa)等配體結(jié)合發(fā)揮抗凝及細胞保護作用[5]。EPCR分為膜結(jié)合型EPCR(Membrane-bound EPCR，mEPCR)和可溶性EPCR(Soluble EPCR，sEPCR)兩種類型，mEPCR表達于內(nèi)皮細胞表面，與PC特異性結(jié)合激活蛋白C發(fā)揮抗凝及抗炎作用，mEPCR被炎癥因子和凝血酶降解后釋放入血，即形成sEPCR[6]。已經(jīng)有研究指出在RA患者的外周血和滑膜組織中可以檢測到sEPCR和mEPCR的異常表達[7-8]；并且在CIA小鼠的體內(nèi)實驗證實，EPCR能夠調(diào)節(jié)Th17細胞的分化，參與RA的疾病進展[8-9]。但目前尚未明確兩種類型的EPCR的異常表達是否會影響疾病的發(fā)展，以及二者的對疾病影響的差異，因此本文進一步研究了sEPCR與mEPCR在RA疾病進展中的作用。

1 材料與方法

1.1EPCR的結(jié)構(gòu)及表達情況分析 通過Gene Expression Ominibus(GEO)數(shù)據(jù)庫，對人類可溶性EPCR和膜型EPCR的基因結(jié)構(gòu)差異進行分析(NCBI參考序列：NM_006404.5)；使用人類蛋白質(zhì)圖譜(The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫，分析EPCR在組織和細胞上的表達情況；并通過整理GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，分析RA、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者和健康個體關(guān)節(jié)滑膜EPCR的表達差異。來自正常人的10個關(guān)節(jié)滑膜樣本(GSM1332201、GSM1332202、GSM1332203、GSM1332204、GSM1332205、GSM1332206、GSM1332207、GSM1332208、GSM1332209、GSM1332210)，OA患者的10個關(guān)節(jié)滑膜樣本(GSM1332211、GSM1332212、GSM1332213、GSM1332214、GSM1332215、GSM1332216、GSM1332217、GSM1332218、GSM1332219、GSM1332220)，以及RA患者的10個關(guān)節(jié)滑膜樣本(GSM1332221、GSM1332222、GSM1332223、GSM1332224、GSM1332225、GSM1332226、GSM1332227、GSM1332228、GSM1332229、GSM1332230)分析RA、OA以及健康個體滑膜上EPCR的表達差異。

1.2動物及試劑 雄性DBA1小鼠(8周齡)購自南京大學(xué)動物模型研究中心。CIA造模成功后將小鼠隨機分為5組：空白組(n=5)，CIA組(n=5)，空載體組(n=5)，sEPCR組(n=5)，mEPCR敲減組(n=5)。用于體內(nèi)實驗的EPCR重組蛋白購自Sino Biological(中國北京)，EPCR腺病毒小干擾載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)和弗氏完全佐劑(CFA)購自Chondrex(美國華盛頓州雷德蒙德)。

1.3CIA誘導(dǎo) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)CIA小鼠。將2 mg/mL的牛Ⅱ型膠原溶于10 mM乙酸中，溫和攪拌，終濃度為4 mg/mL，4 ℃過夜，然后用等體積的完全弗氏佐劑乳化(含4 mg/mL結(jié)核分枝桿菌)。隨后將100 μL乳化的Ⅱ型膠原于DBA1/J小鼠尾根部2 cm處皮內(nèi)注射。21 d后，重復(fù)該過程進行加強免疫建立CIA小鼠模型[10-11]。

1.4EPCR體內(nèi)干預(yù)策略

1.4.1可溶性EPCR的體內(nèi)干預(yù) 為了研究EPCR表達上調(diào)是否可以預(yù)防或緩解關(guān)節(jié)炎，在首次免疫后，參考Meilang Xue等人的研究，對CIA小鼠以0.5 mg/kg的劑量每周兩次進行腹腔內(nèi)注射sEPCR重組蛋白[8, 12]，直至加強免疫，構(gòu)建可溶性EPCR干預(yù)模型。

1.4.2EPCR小干擾載體的體內(nèi)干預(yù) 為進一步證實EPCR在RA疾病進展中的作用，小鼠首次免疫后，以1×109PFU/20g的劑量對EPCR敲減組小鼠進行每周一次的腹腔內(nèi)注射EPCR小干擾載體[13]，下調(diào)CIA小鼠EPCR的表達，直至加強免疫。

1.5臨床癥狀評估 加強免疫后第7 d，對CIA小鼠的關(guān)節(jié)進行連續(xù)評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：4=從踝關(guān)節(jié)到整個爪的腫脹和(或)紅；3=2個以上的關(guān)節(jié)腫脹和(或)紅；2=累及2個關(guān)節(jié)的腫脹和(或)紅；1=1個腳趾關(guān)節(jié)的紅色斑點或腫脹；0=正常。每只小鼠的關(guān)節(jié)評分是四肢評分的總和，最高為16分。

1.6組織病理學(xué)分析 在第28 d 處死CIA小鼠，并進行組織學(xué)和放射學(xué)評估。用錐形束掃描儀(SkyScan 1176；高分辨率體內(nèi)X射線顯微斷層掃描儀，德國布魯克生物公司)獲得后肢的微型計算機斷層掃描平片。之后分離小鼠后肢，并將關(guān)節(jié)固定在福爾馬林中，對標(biāo)本進行進行石蠟包埋處理，組織切片用蘇木素-伊紅染色(HE染色)和甲苯胺藍染色(TB染色)。根據(jù)滑膜組織中炎性細胞浸潤數(shù)量、蛋白多糖損失的程度以及關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕的程度對關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)變化進行評分，評分范圍分別為0～3[10, 12]。

2 結(jié)果

2.1mEPCR和sEPCR結(jié)構(gòu)差異以及EPCR在細胞、組織上的表達差異 目前的研究證實，金屬蛋白酶ADAM17是導(dǎo)致mEPCR脫落產(chǎn)生sEPCR的主要切割酶，通過對GEO數(shù)據(jù)庫的整理發(fā)現(xiàn)了兩種EPCR的結(jié)構(gòu)差異，經(jīng)ADAM17剪切，sEPCR較mEPCR缺少了跨膜區(qū)(圖1A)。EPCR 存在于多種臟器及組織，如肺臟、腎臟、脾、皮膚等(圖1B)，同時，本研究發(fā)現(xiàn)EPCR廣泛表達于各種細胞，如單核細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、T細胞和心肌細胞等(圖1C)。此外，通過對GEO數(shù)據(jù)庫中EPCR在RA患者滑膜組織中的表達水平進行整理，結(jié)果顯示在健康個體、RA患者及OA患者的關(guān)節(jié)滑膜中存在EPCR的表達差異(圖1D)，與健康人群相比，RA及OA患者滑膜中EPCR的表達明顯下降。見圖1。

圖1 mEPCR和sEPCR結(jié)構(gòu)差異以及EPCR在細胞、組織上的表達差異

2.2通過sEPCR干預(yù)可以緩解CIA小鼠的臨床癥狀 為了研究可溶性EPCR在RA中的作用，本研究給予CIA小鼠0.5mg/kg的可溶性EPCR進行體內(nèi)實驗。對小鼠關(guān)節(jié)進行連續(xù)評分可以看出，相比對于對照組，sEPCR可溶性蛋白干預(yù)后，CIA小鼠的關(guān)節(jié)評分明顯降低(圖2A)；沒有給予干預(yù)措施的CIA小鼠有明顯的關(guān)節(jié)紅腫，而給予sEPCR治療后，小鼠四肢關(guān)節(jié)僅表現(xiàn)為輕度的紅腫(圖2B)。在加強免疫后第28 d處死小鼠，并分離后肢，獲得micro-CT(圖2C)，結(jié)果顯示空白對照組小鼠關(guān)節(jié)間隙清晰，邊緣光滑，沒有明顯的骨質(zhì)破壞，而CIA小鼠關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄，并有一定程度的骨侵蝕和關(guān)節(jié)變形，圖2C右側(cè)為給予sEPCR干預(yù)的CIA小鼠關(guān)節(jié)micro-CT，可以看到雖然有一定程度的骨破壞，但相比對照組明顯減輕。上述結(jié)果表明，sEPCR表達的上調(diào)可以減輕炎癥反應(yīng)，保護關(guān)節(jié)的完整性并防止關(guān)節(jié)變形，延緩RA的疾病進展。見圖2。

圖2 sEPCR干預(yù)后CIA小鼠的關(guān)節(jié)評估

2.3mEPCR表達下調(diào)加重CIA小鼠的臨床癥狀 為了進一步研究mEPCR對RA疾病進展的影響，給予小鼠注射EPCR空載體作為陰性對照，實驗組CIA小鼠腹腔注射EPCR小干擾載體下調(diào)CIA小鼠的mEPCR表達，并對小鼠進行關(guān)節(jié)評分。結(jié)果表明，相比空載體干預(yù)對照組小鼠，EPCR表達下調(diào)后小鼠關(guān)節(jié)評分顯著升高，并且可以看到EPCR表達下調(diào)組CIA小鼠相比對照組，四肢關(guān)節(jié)腫脹明顯(圖3A-B)。同樣，對兩組小鼠進行了Micro-CT檢查，結(jié)果顯示(圖3C)，EPCR表達下調(diào)后，有顯著的骨侵蝕和骨破壞，關(guān)節(jié)間隙狹窄也更為嚴(yán)重。以上結(jié)果表明，mEPCR可能對關(guān)節(jié)有保護作用，其表達下調(diào)會加重RA的關(guān)節(jié)表現(xiàn)，導(dǎo)致RA病情加重。見圖3。

圖3 mEPCR表達下調(diào)CIA小鼠的關(guān)節(jié)評估

2.4sEPCR干預(yù)緩解 CIA小鼠的骨侵蝕 對CIA小鼠的關(guān)節(jié)進行了HE染色和甲苯胺藍染色。圖4A為小鼠關(guān)節(jié)的HE染色。左側(cè)為空白對照組，可以看到關(guān)節(jié)軟骨表面光滑整潔，軟骨細胞排列整齊，分布均勻，染色均一，軟骨下骨染色均勻，與軟骨分界清晰；而CIA對照組關(guān)節(jié)破壞明顯，有明顯的軟骨及骨侵蝕，軟骨連續(xù)性中斷，骨與軟骨界限模糊，高倍鏡下可見到軟骨層變薄，細胞排列紊亂，毀損嚴(yán)重；右側(cè)為sEPCR干預(yù)組小鼠的關(guān)節(jié)，可以看到軟骨細胞分布相比CIA對照組小鼠較為均勻，骨和軟骨的破壞明顯減輕。圖4B圖為小鼠后肢關(guān)節(jié)的甲苯胺藍染色。左側(cè)為空白對照組，可以看到紫藍色為軟骨基質(zhì)，主要成分為蛋白多糖；中間為CIA組，可以看到關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨染色基質(zhì)染色較淺，面積減小，蛋白多糖丟失和滑膜浸潤明顯，軟骨和骨侵蝕較重；而給予sEPCR干預(yù)后，關(guān)節(jié)間隙狹窄、骨和軟骨破壞得到顯著改善，蛋白多糖的丟失較CIA對照組減少。圖4C為根據(jù)蛋白多聚糖的丟失情況以及關(guān)節(jié)破壞情況對各組小鼠的后肢關(guān)節(jié)進行組織學(xué)評分。這些結(jié)果表明，sEPCR表達上調(diào)可以減少炎性細胞的浸潤，保護關(guān)節(jié)的完整性，減少骨和軟骨的破壞，控制RA疾病病情的發(fā)展。見圖4。

圖4 給予sEPCR重組蛋白干預(yù)后，二次免疫結(jié)束后第28 d的結(jié)果

2.5EPCR小干擾載體的干預(yù)加重CIA小鼠的骨破壞 給予CIA小鼠EPCR小干擾載體干預(yù)后，對小鼠關(guān)節(jié)進行組織學(xué)評估。圖5A為小鼠后肢關(guān)節(jié)的HE染色，結(jié)果顯示，相比陰性對照組以及給予空載體干預(yù)的CIA小鼠，給予EPCR小干擾載體后，關(guān)節(jié)軟骨層完整性被破壞，軟骨細胞分布不均，軟骨下骨侵蝕加重，關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯。對關(guān)節(jié)進行甲苯胺藍染色結(jié)果顯示，EPCR敲減組小鼠關(guān)節(jié)的軟骨及骨破壞較對照組小鼠更為嚴(yán)重，軟骨基質(zhì)染色面積減小，蛋白多糖丟失增加(圖5B)。圖5C為對關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)評分。綜上，給予EPCR小干擾載體干預(yù)后，mEPCR表達降低而導(dǎo)致CIA小鼠表現(xiàn)為明顯的關(guān)節(jié)炎癥，包括炎癥細胞浸潤和蛋白多聚糖丟失增加以及更為嚴(yán)重的骨和軟骨侵蝕，也就是說，mEPCR表達下調(diào)能夠介導(dǎo)RA疾病加重。見圖5。

3 討論

mEPCR主要表達于細胞內(nèi)皮表面，可以與PC結(jié)合，進一步活化PC，發(fā)揮抗凝及細胞保護作用；EPCR釋放入血后，形成sEPCR，可以結(jié)合PC抑制APC的產(chǎn)生，或與APC結(jié)合阻斷APC的細胞保護功能[14]。在以內(nèi)皮細胞功能障礙為特點的自身免疫性疾病中可檢測到sEPCR的水平升高，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者的外周血中可檢測到sEPCR水平明顯增加，尤其以累及腎臟的患者為著，可以作為血管損傷的標(biāo)志物[15]。Faioni, E等人[16-17]的研究顯示在炎癥性腸病患者中，sEPCR的水平明顯增高，但在疾病靜止期與活動期sEPCR的水平?jīng)]有明顯差異，相反，mEPCR的水平是降低的，這使得PC通路受阻，APC活化減少，炎癥加重。本文通過對GEO數(shù)據(jù)庫的整理發(fā)現(xiàn)，在RA患者的滑膜組織中也存在EPCR的異常表達，其表達水平顯著低于健康對照組，因此我們提出EPCR的表達下調(diào)能否介導(dǎo)RA疾病進展。我們的實驗通過給予小鼠腹腔內(nèi)注射EPCR敲減載體，使CIA小鼠mEPCR表達水平下調(diào)，發(fā)現(xiàn)小鼠四肢關(guān)節(jié)紅腫程度加重，進一步的組織病理學(xué)分析同樣驗證了上述觀點。

此外，EPCR可以介導(dǎo)APC通過抑制單核細胞的遷移以及NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和TNF-α等促炎因子產(chǎn)生[7, 18-19]。NF-κB是RA滑膜細胞中誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的一個重要的細胞內(nèi)信號通路，[20-21]因此抑制NF-κB的激活和炎癥因子的釋放，可以有效控制炎癥；EPCR還能夠通過調(diào)節(jié)Th17細胞的分化[8, 22]，發(fā)揮抑炎作用，減少骨和軟骨的破壞，因此EPCR水平的升高可能會對RA的異常免疫和炎癥起到保護作用。我們推測RA患者表現(xiàn)的炎癥反應(yīng)可能與EPCR表達降低有關(guān)。Meilang Xue等人的研究指出[7]，在給予CIA小鼠EPCR或APC處理后，觀察到小鼠的關(guān)節(jié)癥狀可以得到明顯的改善。我們通過給予CIA小鼠體內(nèi)注射sEPCR重組蛋白上調(diào)小鼠sEPCR的表達，觀察到小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀得到了一定程度的控制，骨破壞和骨侵蝕相應(yīng)減輕。

有研究指出，T細胞表面的EPCR可與免疫共分子協(xié)同表達，如PD-1/CTLA-4及ICOS等。抑制炎癥的新型生物制劑阿巴西普(abatacept，CTLA-4Ig融合蛋白)是一種共刺激抑制劑，與其他的生物制劑相比較，它可以在炎癥級聯(lián)反應(yīng)的上游發(fā)揮作用。研究指出共刺激抑制劑可以與APC表面的B7分子結(jié)合，干擾B7-CD28協(xié)同共刺激途徑，從而阻斷T細胞活化，控制RA炎癥并改善關(guān)節(jié)破壞[23-25]。進一步的研究顯示sEPCR能夠抑制Th17細胞分化，并影響Th17/Treg細胞的比例，這一過程能夠參與RA的疾病進展。

綜上所述，可溶性和膜型EPCR的異常表達對RA的疾病進展具有重要作用，其中sEPCR的表達上調(diào)可以減慢疾病進展；相反，mEPCR表達下調(diào)會加重RA病情。這一現(xiàn)象提示，EPCR具有作為一種新型的RA的治療干預(yù)靶點的應(yīng)用潛力。