李丹霞，童康強，張曉璐，周佳林，韓建國，韓彥軍，邵 國，張春陽

[1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué))；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心]

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)一直是各年齡段發(fā)病率、致殘率和死亡率的主要原因之一，雖然最初的腦損傷涉及急性和不可逆的原發(fā)性腦實質(zhì)損傷，但隨后的繼發(fā)性腦損傷通常會在數(shù)月至數(shù)年內(nèi)緩慢進展，因此為治療干預(yù)提供了一個窗口[1]。目前已經(jīng)證實干細胞移植能夠促進腦損傷的功能恢復(fù)，而聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)有承載細胞的能力[2]。研究神經(jīng)修復(fù)機制中發(fā)現(xiàn)NgR(Nogo receptor)信號傳導(dǎo)通路是其中一條重要的機制[3]，通過抑制NgR的表達，使軸突生長抑制受限，促進受損的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，我們運用組織工程學(xué)方法，將NgR基因沉默的神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSC)和雪旺細胞(Schwann cells,SC)-PLGA復(fù)合體移植至創(chuàng)傷性腦損傷大鼠皮層損傷區(qū)，觀察移植復(fù)合體在大鼠皮層損傷區(qū)通過改變局部微環(huán)境促進神經(jīng)元的存活、軸突再生及功能恢復(fù)情況。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年雌性Lewis大鼠48只，體重約250g。PLGA(廣州創(chuàng)賽生物醫(yī)用材料有限公司)，DEME培養(yǎng)基、胎牛血清(廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司)，兔抗鼠NgR基因抗體、山羊抗兔抗體(武漢博士德公司)；慢病毒載體構(gòu)建(漢恒生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；NeroTMTransfection系統(tǒng)(賽默飛世爾生命科技有限公司)；電子顱腦損傷儀(e CCI Model-6.3，Custom Design & Fabrication，Inc，美國)；顯微器械(上海金鐘)。

1.2方法

1.2.1細胞準備 取E12.5 d孕母鼠胚胎，獲取端腦，并分離、純化、擴增神經(jīng)干細胞和雪旺細胞，沉默NgR基因由美吉生物公司設(shè)計并合成，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用NeroTMTransfection系統(tǒng)，在35 mm培養(yǎng)皿中用shRNA-NgR轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞和雪旺細胞。并篩選出表達shRNA-NgR的神經(jīng)干細胞和雪旺細胞，進行傳代、擴增。

1.2.2細胞支架復(fù)合體的制備 PLGA經(jīng)疏水蛋白HFBI和Ⅰ型膠原聯(lián)合修飾后，將其剪裁成2.5 mm×1.5 mm×1.5 mm的支架，真空干燥并消毒。Ⅲ組吸取4×1 010個/L的NSC和SC各10 μL至PLGA支架內(nèi)；Ⅳ組用吸取4×1010個/L的NgR基因沉默的NSC和SC各10 μL至PLGA支架。根據(jù)制造商說明，將PLGA支架復(fù)合體置于培養(yǎng)基中 溫育24 h后，然后在37 ℃，5 %CO2濕潤的培養(yǎng)箱中再孵育24 h。

2.1改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(mNSS) 結(jié)果顯示，與Ⅰ組比，Ⅱ組神經(jīng)功能評分明顯升高(P<0.05)；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組神經(jīng)功能評分明顯下降(P<0.05)，且Ⅳ組優(yōu)于Ⅲ組接近于Ⅰ組(P<0.05)。見表1。

1.2.3分組和TBI造模 隨機將大鼠分為4組，每組12只，正常對照組(Ⅰ組)、單純PLGA移植組(Ⅱ組)、神經(jīng)干細胞+雪旺細胞+PLGA復(fù)合體移植組(Ⅲ組)、沉默NgR基因+神經(jīng)干細胞+雪旺細胞+PLGA復(fù)合體移植組(Ⅳ組)。術(shù)前將大鼠置于在有自然光安靜的房間內(nèi)適應(yīng)一周，直至不再有害怕的表情(蜷縮、尿頻、便頻、尖叫)。禁食水8 h后，用5 %的氯胺酮對大鼠腹腔注射麻醉，麻醉成功后，俯臥位固定，置于立體定向儀上，剪除毛發(fā)，消毒后沿正中線切開頭皮，暴露右側(cè)頂骨，矢狀縫向右旁開1.5 mm,冠狀縫向后1.5 mm,磨一直徑約5 mm的骨窗，暴露硬腦膜并保持硬腦膜完整。對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠行eCCI打擊建立經(jīng)典顱腦損傷動物模型[3]。設(shè)置打擊參數(shù)：深度2 mm,速度5 m/s,錘擊時間100 s。然后剪開硬腦膜，Ⅱ組于損傷區(qū)植入單純PLGA支架，Ⅱ組于損傷區(qū)植入單純PLGA支架，Ⅲ組于損傷區(qū)植入神經(jīng)干細胞+雪旺細胞+PLGA復(fù)合體，Ⅳ組于損傷區(qū)植入沉默NgR基因+神經(jīng)干細胞+雪旺細胞+PLGA復(fù)合體。移植結(jié)束后常規(guī)縫合大鼠硬腦膜、頭皮。

（4）對于工業(yè)控制網(wǎng)絡(luò)設(shè)備資產(chǎn)的管理與監(jiān)控能力不足。目前絕大多數(shù)的工業(yè)控制網(wǎng)絡(luò)中并沒有對于其設(shè)備資產(chǎn)的管理與監(jiān)控機制，容易受到攻擊。

1.2.5HE染色和顯微鏡觀察 在造模后1個月處死大鼠，于大鼠皮層損傷區(qū)取材，石蠟包埋切片，HE染色，在40倍、200倍、400倍光學(xué)顯微鏡觀察。

圓筒段需先進行地基處理再開挖施工，作業(yè)面分段提交，考慮到分段提交時作業(yè)面較窄，無法投入較多的設(shè)備同時施工。計劃投入1艘8方抓斗船（配備有6方小斗），1艘抽砂泵船進行施工， 3區(qū)施工時視情況調(diào)派水上鉤機協(xié)助方樁拔出施工。

1.2.4改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(mNSS) 于建模后1、2、4周，采用雙盲法對所有大鼠進行神經(jīng)功能檢測。采用國際通用的改良mNSS神經(jīng)功能缺損評分檢測，重復(fù)檢測3次取其平均值(0～18分)。

2.2神經(jīng)干細胞的存活及分化情況 造模后1個月HE染色，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組損傷區(qū)組織斷裂，有空洞形成；與Ⅱ組比較，Ⅲ組、Ⅳ組移植處的空洞較少；與Ⅲ組比較，Ⅳ組移植處的空洞較少。見圖1。

2 結(jié)果

從定義上來看，地理信息生成系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)反映的是空間地理實體位置、屬性和拓撲關(guān)系，側(cè)重點在于空間信息和屬性信息；地圖制圖中的數(shù)據(jù)最終會以地圖產(chǎn)品輸出，更側(cè)重形象、直觀地描述地球表面的自然地理和社會人文等要素。

表1 不同組別大鼠改良mNSS評分

圖1 各組小鼠損傷區(qū)組織HE染色

3 討論

人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在具有自我更新能力和多向分化潛能的神經(jīng)干細胞，而具有再生能力的NSC發(fā)揮功能與干細胞微環(huán)境和自身的基因表達存在密切聯(lián)系。SC可合成和釋放生物活性因子，誘導(dǎo)神經(jīng)元生長錐生長、軸突生成。NSC向神經(jīng)元的分化率很低，且神經(jīng)元的軸突生長方向不易控制。研究表明在神經(jīng)損傷后的NSC能夠在具有適宜微環(huán)境的移植物中生長、分化、增殖[4-5]。因此，移植后的神經(jīng)干細胞修復(fù)受自身基因的表達和微環(huán)境的影響。NgR是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中限制神經(jīng)元再生的主要分子，Nogo蛋白通過與NgR結(jié)合可導(dǎo)致生長錐塌陷并抑制神經(jīng)元軸突的延伸[6]。有動物實驗發(fā)現(xiàn)Nogo蛋白能促進臂叢神經(jīng)斷裂的再生[7]。Hu等[8]研究也顯示了Nogo在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的調(diào)節(jié)中起重要作用。Solomom等[9]發(fā)現(xiàn)了通過抑制NgR信號傳導(dǎo)能促進視神經(jīng)損傷后軸突的重新伸展。最近的研究發(fā)現(xiàn)，通過對TBI小鼠進行NgR的調(diào)控，可以影響小鼠的記憶、認知和情緒，對于NgR過表達的小鼠出現(xiàn)了海馬依賴性損傷，表明了NgR是突觸形成的調(diào)控因子，能穩(wěn)定和塑造記憶功能[10]。這些研究均表明了NgR在神經(jīng)元的再生中有重要作用。NgR基因的敲除，為TBI的治療提供了一個靶點。通過慢病毒載體轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生NgR抗體，阻止NgR對神經(jīng)元再生的抑制，可促進NSC軸突再生[11]。

NSC能增加神經(jīng)元的數(shù)量，SC能夠分泌各種營養(yǎng)因子，為神經(jīng)元的生長提供合適的環(huán)境，而對NgR進行抑制能促進軸突生長，因此，將三者相結(jié)合，可能更有助于中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)，其效果可能大于單一修復(fù)。但是如何將三者完美結(jié)合，亦是一個必須面對的課題。有學(xué)者將NSC或SC移植于周圍神經(jīng)或脊髓損傷區(qū)，但是很多情況下受損區(qū)域只是被雜亂無章的膠質(zhì)瘢痕所取代[12]，其原因可能是損傷后的干細胞缺乏誘導(dǎo)，無法控制軸突生長方向，導(dǎo)致其無法定向生長，幾乎對神經(jīng)修復(fù)不產(chǎn)生作用。而組織工程技術(shù)應(yīng)用恰恰能對解決這一問題提供幫助。組織工程的核心是用生物材料構(gòu)建出細胞和組織的替代品并且促進生物功能的恢復(fù)[13]。生物材料提供了一個細胞貼附、增殖、分化的可調(diào)控的三維立體微環(huán)境[14]。常見的組織工程支架PLGA能給細胞定向生長提供一個框架，阻止其雜亂生長，通過調(diào)整支架的形狀達到預(yù)想的生長方向。已有研究將NSC移植于PLGA中，發(fā)現(xiàn)PLGA確實能引導(dǎo)NSC的生長，但是其中存在著各種各樣的問題，較為常見的是如何使移植細胞在PLGA上貼壁生長[15]。最新的研究發(fā)現(xiàn)了一種天然生物聚合物貼附蛋白(mussel adhesive protein，MAP),由于其獨特的粘合作用，賦予細胞粘附，細胞增殖和生物相容的性能，解決了傳統(tǒng)的聚合物使細胞貼附困難的問題[16]。

繪制符號首先要從其外觀上進行設(shè)計，從路燈符號角度來講，其結(jié)構(gòu)很簡單，主要是由一個燈桿和燈泡組成。在設(shè)計時，燈桿和燈泡盡可能簡單明了。本文給出了一個燈桿和2個球體燈泡的設(shè)計樣式，如圖2所示。

本研究將NgR基因沉默的NSC和SC聯(lián)合移植于創(chuàng)傷性腦損傷大鼠皮層損傷區(qū)，既增加了神經(jīng)元的數(shù)量，又提供了神經(jīng)元生長的微環(huán)境，并促進了軸突生長。而且又有組織工程支架PLGA，為神經(jīng)干細胞的生長提供了一個定向生長的空間，避免其雜亂生長，為神經(jīng)的定向修復(fù)提供了保駕。而且在體外培養(yǎng)時，我們發(fā)現(xiàn)NSC和SC在PLGA支架上聯(lián)合培養(yǎng)比NSC單一培養(yǎng)在PLGA支架上貼壁、分化，增殖更容易，這又大大解決了細胞在PLGA支架上貼壁生長困難這一問題。有研究[17]將NgR基因沉默后的骨髓間充質(zhì)干細胞和SC移植于大鼠脊髓損傷區(qū),采用組織工程材料提供支架，同時在體外培養(yǎng)，使其形成一個組織工程化的橋接器件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NgR基因沉默后的聯(lián)合移植對脊髓損傷的修復(fù)優(yōu)于NgR基因未沉默的移植。這與本研究將NgR基因沉默神經(jīng)干細胞和雪旺細胞-PLGA移植于創(chuàng)傷性腦損傷大鼠皮層損傷區(qū)促進神經(jīng)元軸突再生，并有助于運動功能的恢復(fù)的研究結(jié)果相一致。說明了這種將NgR基因沉默神經(jīng)干細胞和雪旺細胞聯(lián)合移植的方法有助于中樞神經(jīng)的損傷修復(fù)，并且用組織工程材料PLGA支架能夠極大程度上誘導(dǎo)細胞的定向生長，對神經(jīng)的修復(fù)提供助益。本動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)NgR基因沉默，比NgR基因未沉默的神經(jīng)干細胞和雪旺細胞-PLGA復(fù)合體移植對大鼠運動能力的恢復(fù)更優(yōu)，并且組織學(xué)結(jié)果也有相同的發(fā)現(xiàn)。將NgR基因沉默神經(jīng)干細胞和雪旺細胞-PLGA共移植于創(chuàng)傷性腦損傷大鼠可促進神經(jīng)修復(fù)，可能為人TBI的修復(fù)提供了一個可行的研究思路。