王燦燦，林海鷗，劉書(shū)宇，唐文偉，曾東強(qiáng)

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系 南寧市 530005）

香附子Cyperus rotundusL.，為莎草科Cypera?ceae 莎草屬Cyperus植物，又名三菱草、莎草、回頭青等，原產(chǎn)于印度，國(guó)內(nèi)分布于陜西、甘肅、山西、河南、河北、山東、江蘇、浙江、江西、安徽、云南、貴州、四川、福建、廣東、廣西和臺(tái)灣等省區(qū)[1]。

香附子是玉米、甘蔗、蔬菜等農(nóng)作物田的惡性雜草，嚴(yán)重危害農(nóng)作物的生長(zhǎng)，但其根莖是一種常見(jiàn)的中草藥，在民間常用于治療各種炎癥性疾病，有“婦科圣藥”、“氣中之血藥”之稱。香附子揮發(fā)油現(xiàn)已在我國(guó)實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，主要采用β-環(huán)糊精對(duì)其進(jìn)行包合，并制成相應(yīng)的制劑，如膠囊劑等，用于治療各種臨床疾病[2]。前人對(duì)香附子化學(xué)成分已進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，基本明確其主要的化學(xué)成分類型有倍半萜、單萜、三萜、黃酮、糖苷、甾醇、生物堿及其他類化合物。目前，對(duì)于香附子根莖化學(xué)成分活性的研究主要集中在人體病原細(xì)菌及真菌，初步的研究結(jié)果表明，香附子中具有抑制植物病原真菌的活性成分。

本研究擬采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定香附子根莖甲醇粗提物及其萃取物對(duì)常見(jiàn)植物病原真菌的抑菌活性，以期為進(jìn)一步提取分離香附子根莖中抑菌活性成分、為尋找新型殺菌劑的先導(dǎo)化合物提供依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香附子根莖

采自廣西大學(xué)扶綏農(nóng)科基地甘蔗田。選取生長(zhǎng)狀況良好的香附子根莖。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，分析純（天津富宇試劑公司和成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)）。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4 植物病原真菌

火龍果潰瘍病菌Neoscytalidium dimidiatum（Penz.） Crous & Slippers、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearumSchwabe、苦瓜枯萎病菌Fusarium oxysporunf.sp.Momordicae、馬鈴薯立枯絲核菌Rhizoctonia solaniKühn、姜白絹病菌Sclerotium rolf?sii、甘蔗梢腐病菌Fusarium moniliformeSheldon、香蕉煤紋病菌Helminthosporium torulosum（Syd.）Ashby.、 甘 蔗 鳳 梨 病 菌Ceratocystis paradoxaMoreau、 甘 藍(lán) 黑 斑 病 菌Alternaria brassicicola（Schw）Wiltshire，以上植物病原真菌均來(lái)源于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室，菌種保存于4℃冰箱，試驗(yàn)前重新接菌活化以備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香附子根莖提取物制備

1.2.1.1 甲醇粗提物制備

將采集的香附子根莖用清水清洗干凈，在通風(fēng)良好的地方晾干，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱于50℃烘干后進(jìn)行粉碎處理，過(guò)100 目篩，得到5 kg 粉末。將粉碎后的樣品置于3 L的錐形瓶中，用甲醇冷浸超聲（2 h/次）提取3 次（樣品：甲醇體積比1∶5）后過(guò)濾，將收集得到的濾液于55℃減壓濃縮至近干，得到1 200 g甲醇粗提物浸膏。

1.2.1.2 萃取物制備

將香附子根莖甲醇粗提物浸膏加適量的去離子水懸浮，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并萃取液，濃縮至膏狀，分別得到香附子根莖的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相濃縮物。

1.2.2 香附子根莖提取物抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定香附子根莖甲醇粗提物和各萃取物對(duì)9種植物病原真菌的抑制作用[9]。分別稱取定量（甲醇粗提物1 g，萃取物0.5 g）的待測(cè)提取物，加入一定量的甲醇（甲醇含量不超過(guò)2%），充分溶解，加入無(wú)菌水配成目標(biāo)濃度的母液（甲醇粗提物為1 000 mg/mL，萃取物為500 mg/mL），取 1 mL 與 99 mL 的 PDA 培養(yǎng)基融合，充分混勻，倒入直徑7.5 cm 的培養(yǎng)皿中，得到供試含藥培養(yǎng)基，置于超凈工作臺(tái)中冷卻，用菌種打孔器從活化好的菌種培養(yǎng)基上打出直徑6 mm的菌餅，將菌餅倒放于培養(yǎng)基的中央，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，以含有等量甲醇的處理為對(duì)照組。待對(duì)照組菌落直徑達(dá)到5 cm 以上時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并按下述公式計(jì)算其抑菌率。

抑菌率（%）=（D1-D2）/(D1-6)×100

式中D1表示對(duì)照組菌落直徑，D2表示處理組菌落直徑（單位：cm）。

1.2.3 香附子根莖萃取物對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定

選取各萃取物對(duì)供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率在70%以上的病原真菌采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行進(jìn)行毒力測(cè)定。將待測(cè)萃取物用一定量的甲醇溶解，用無(wú)菌水稀釋成濃度為500 mg/mL 的母液，然后用倍半稀釋法制成一系列濃度梯度的母液。在超凈工作臺(tái)中，取1 mL 系列濃度梯度的母液與99 mL 已融化的PDA 培養(yǎng)基混合，分別配置成濃度為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL 和0.312 5 mg/mL 等一系列的含藥培養(yǎng)基。其他操作步驟同1.2.2。計(jì)算香附子根莖各萃取物對(duì)病原真菌的EC50。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2019 和SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差分析采用單因素分析（ANOVA）和Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 香附子根莖提取物對(duì)病原真菌抑菌活性的測(cè)定

香附子根莖甲醇粗提物對(duì)9種供試植物病原真菌的抑菌活性結(jié)果（見(jiàn)表1）表明：其對(duì)供試植物病原真菌均具有一定程度的菌絲生長(zhǎng)抑制活性。在10 mg/mL濃度下對(duì)姜白絹病菌的抑制效果最為顯著，抑制率達(dá)到了100%；對(duì)禾谷鐮刀菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制效果次之，抑制率分別為81.84%、81.21%；馬鈴薯立枯絲核菌、甘蔗梢腐病菌和香蕉煤紋病菌的抑制作用最差，抑制率在43.79%~46.07%之間。

在5 mg/mL濃度下，石油醚萃取物對(duì)9供試植物病原真菌的抑制率均在50.00%以上，其中對(duì)禾谷鐮刀菌、姜白絹病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制效果最為顯著，抑制率在85%以上，對(duì)香蕉煤紋病菌的抑制效果最差，抑制率僅有50.00%；乙酸乙酯萃取物對(duì)禾谷鐮刀菌、苦瓜枯萎病菌、姜白絹病菌、甘蔗鳳梨病菌和甘藍(lán)黑斑病菌的抑制率均達(dá)到90%以上，對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌和甘蔗梢腐病菌的抑制作用最差，抑制率在60%以下，正丁醇萃取物僅對(duì)火龍果潰瘍病菌、馬鈴薯立枯絲核菌、甘蔗梢腐病菌等3種病原菌具有抑菌活性，且抑制率僅在50%左右，水萃取物則對(duì)供試植物病原真菌均無(wú)抑制作用。生物活性測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，香附子根莖中具有抑菌活性成分可能主要分布于石油醚和乙酸乙酯萃取物中。

表1 香附子根莖提取物對(duì)9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性

2.2 香附子根莖萃取物對(duì)植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力

2.2.1 石油醚萃取物對(duì)植物病原真菌絲生長(zhǎng)的毒力

香附子根莖石油醚萃取物對(duì)供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定，抑制效果見(jiàn)表2 和圖1。結(jié)果表明，石油醚萃取物對(duì)所測(cè)定5種菌的EC50均較低，其中火龍果潰瘍病菌和姜白絹病菌的抑制作用的EC50最低，分別為0.36 mg/mL和0.37 mg/mL，對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果次之，EC50分別為0.50 mg/mL；但與對(duì)照藥劑的EC50相比，仍有較大的差距。

表2 香附子石油醚萃取物對(duì)5種植物病原真菌的EC50值

2.2.2 乙酸乙酯萃取物對(duì)植物病原真菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定

香附子根莖乙酸乙酯萃取物對(duì)供試病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定結(jié)果表明（表3、圖2），乙酸乙酯萃取物對(duì)所測(cè)定6種病原真菌中，對(duì)火龍果潰瘍病菌、姜白絹病菌和甘蔗鳳梨病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50較低，分別為 0.42 mg/mL、0.52 mg/mL 和0.35 mg/mL，對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌的抑制效果次之，其EC50為0.9 mg/mL，對(duì)禾谷鐮刀菌和苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50均為1.16 mg/mL；但與對(duì)照藥劑的EC50相比，仍存在較大的差距，香附子根莖乙酸乙酯萃取物的EC50在0.35～1.16 mg/mL，而對(duì)照藥劑的EC50在0.03～1.90 μg/mL。

圖1 香附子石油醚萃取物在不同濃度下對(duì)5種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

圖2 香附子乙酸乙酯萃取物在不同濃度下對(duì)6種病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

表3 香附子乙酸乙酯萃取物對(duì)6種植物病原真菌的EC50值

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)供試植物病原真菌的抑制均較好。香附子根莖的活性成分集中分布在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

本研究中石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)鐮刀菌屬的3 種病原真菌（F.graminearum、F.oxysporum、F.moniliforme）的抑菌結(jié)果表明，2 種萃取物對(duì)禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和苦瓜枯萎病菌（F.oxysporum）抑制效果較好，對(duì)甘蔗梢腐病菌（F.moniliforme）的抑制效果次之，其中對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率均在80%以上，對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制率均在69%以上。Zahide ?zdemir等人的研究表明，香附子根莖乙酸乙酯提取物對(duì)Botrytis cinerea和Fusarium udum菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有抑制作用[3-4]。且香附子根莖石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)鏈格孢菌屬的甘藍(lán)黑斑病菌的抑制率分別為為78.28%和100%。Singh A 等人的研究表明香附子根莖乙酸乙酯提取物對(duì)鏈格孢菌屬 （A.alternata、A.brassisicola、A.solani、A.chearanthi和A.brassisicola）的抑制效果較好[5]。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)姜白絹病菌（S.rolfsii）、火龍果潰瘍菌（N.dimidiatum）和甘蔗鳳梨病菌（N.dimidiatum）均有較好的抑制效果，其抑制率均在75%以上。

目前香附子中已鑒定結(jié)構(gòu)的有1,8-cineole、amentoflavone、 ginkgetin、 bilobetin 和 sciadopitysin、physcion 等多種類型的化合物[6-9]，通過(guò)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，已在其他植物中分離并有相關(guān)活性的研究。研究表明，藍(lán)桉中的單萜類化合物1,8-cineole 對(duì)真菌黃曲霉Aspergillus flavusLink和寄生曲霉Aspergillus parasiticusSpeare 的均抑制作用[10]。紅豆杉和銀杏中分離的雙黃酮類化合物amentoflavone、ginkgetin、bilobetin 和 sciadopitysin 對(duì)交替交鏈格孢Alternaria alternata、鐮刀菌Fusarium culmorum、尖孢枝孢菌Cladosporium oxysporum均有一定的抑制作用；sciadopitysin 對(duì)鐮刀菌的抑制效果較好，其 ED50為 9 μM；bilobetin 對(duì) 3 種供試植物病原真菌有顯著的抗真菌活性，其ED50分別為14、11 和17μM，在100 μM 濃度下完全抑制了尖孢霉和鐮刀菌萌發(fā)管的生長(zhǎng)[11]。此外，人工合成的蒽醌類化合物physcion 可顯著降低了番茄灰霉病的發(fā)病率，以9 g a.i./ha 的劑量施用physicon，可使發(fā)病率降低63.44%～69.79%，與殺菌劑乙胺嘧啶酯的抑制效果相當(dāng)[12]。本研究結(jié)果顯示，香附子根莖石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物對(duì)多種植物病原真菌有很好的抑菌效果，值得進(jìn)一步的研究。