胡 楊，李先芝，2，劉 洋，林 露，石 豪，毛瓊麗，嚴 玲

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435112）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子(Cuscuta australisR.Br.)或菟絲子(Cuscuta chinesisLam.)的干燥成熟種子，表面灰棕色至棕褐色，其味甘性平，歸肝、腎、脾經(jīng)，具有補益肝腎，固精縮尿，安胎，明目之功效[1]。菟絲子作為一種補益類中藥，在我國有著悠久的歷史。已有研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子主要含有黃酮類、生物堿類、氨基酸及多糖類等有效活性成分[2-6]，具有抗衰老，抗氧化，調(diào)節(jié)免疫力，改善生殖系統(tǒng)，預防骨質(zhì)疏松[7-14]等功效，擁有很高的藥用保健價值，是保健酒用原料之一。

菟絲子提取液是以菟絲子原藥材為原料，以50%食用酒精為提取溶劑，經(jīng)過提取、離心、過濾、濃縮等工序獲取。目前對菟絲子活性成分研究已有報道[15-17]，但對菟絲子提取液的質(zhì)量標準研究報道鮮為少見。本文通過建立菟絲子提取液指紋圖譜及其主要活性成分含量的檢測，為合理評價菟絲子提取液質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：10批菟絲子提取液由勁牌公司提供。

對照品：金絲桃苷（批號111521—201708 純度95.1 %）（中國藥品檢定研究院），紫云英苷（批號CFN98733 純度98%）（ChemFaces）。

試劑：甲醇、磷酸（色譜純），95 %乙醇（分析純），水為超純水。

儀器設備：高效液相色譜儀（賽默飛公司，uLtiMate 3000，美國），電子分析天平（賽多利斯SQP，德國），數(shù)控超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司，中國），PURELAB-超純水儀（PURELAB classic UV，英國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菟絲子提取液的指紋圖譜

1.2.1.1 標準溶液的制備

分別取對照品金絲桃苷、紫云英苷適量，精密稱定，用50%乙醇配制成每1 mL 中含有金絲桃苷90 μg、紫云英苷25 μg的對照品溶液。

1.2.1.2 菟絲子提取液的制備

菟絲子提取液是由勁牌公司生產(chǎn)車間規(guī)模提取。稱取一定量的菟絲子藥材投入提取容器中，加入8倍量的50%食用酒精，充分提取3次，每次2 h，合并提取液，對提取液進行離心分離，離心后的澄清液依次用陶瓷膜、超濾膜進行分離，最后采用納濾膜進行濃縮，即得菟絲子提取液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備

直接吸取菟絲子提取液過0.45 μm 微孔濾膜，過濾，即得。

1.2.1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇（A）-0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫見表1；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長360 nm。在此色譜條件下記錄色譜圖。

表1 菟絲子提取液檢測流動相洗脫程序

1.2.2 金絲桃苷、紫云英苷含量檢測

1.2.2.1 色譜條件

同“1.2.1.4”項。

1.2.2.2 對照品溶液的制備

分別取對照品金絲桃苷、紫云英苷適量，精密稱定，制成每毫升含有金絲桃苷595.35 μg、紫云英苷56.2275 μg的對照品溶液母液。

1.2.2.3 菟絲子提取液的制備

制備方法同“1.2.1.2”。

1.2.2.4 供試品溶液的制備

精密量取菟絲子提取液10 mL 至20 mL 的量瓶中，用50%乙醇定容至刻度線，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2 結果與分析

2.1 菟絲子提取液的指紋圖譜構建

2.1.1 精密度試驗

取同一批次的菟絲子提取液適量（編號：S10），按照1.2.1.2 供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4 色譜條件連續(xù)進樣6 次，以金絲桃苷峰為參照，記錄各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，9 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于2 %（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的菟絲子提取液適量（編號：S10），按照1.2.1.2 供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4 色譜條件分別在0、8 h、10 h、13 h、18 h、24 h 進樣，以金絲桃苷峰為參照，記錄各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，9 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于2 %（n=6），表明菟絲子提取液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

表2 菟絲子提取液中9個共有峰的相對保留時間和相對峰面積結果

2.1.3 重復性試驗

取同一批次的菟絲子提取液6 份（編號：S10），按照1.2.1.2 供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4 色譜條件進行測定，以金絲桃苷峰（峰6）為參照，記錄各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果見表2。9 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于2 %（n=6），表明此方法的重復性良好。

2.1.4 指紋圖譜共有模式的生成及共有峰的確定

取10批不同批次的菟絲子提取液，按照1.2.1.2供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4色譜條件進行測定，得到10批菟絲子提取液的色譜圖見圖1，并對得到的樣品色譜圖中各色譜峰進行積分處理，得到樣品疊加圖見圖2。通過與對照品色譜圖比較，9 個色譜峰中6 號峰為金絲桃苷，7號峰為紫云英苷。

2.1.5 10批菟絲子提取液指紋圖相似度評價（表3）

圖1 混合對照品（A）色譜圖與菟絲子提取液（B）指紋圖譜共有模式

將10 批不同批次的菟絲子提取液高效液相指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，進行色譜峰匹配以及相似度的分析，并采用中位數(shù)法生成共有模式對照圖譜。結果顯示，10批次的菟絲子提取液樣品的指紋圖譜的相似度在0.95以上，說明不同批次的菟絲子提取液具有良好的一致性。

2.2 金絲桃苷、紫云英苷含量檢測

2.2.1 線性關系考察

將金絲桃苷對照品溶液母液分別吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2 mL 至10 mL 量瓶中，將紫云英苷對照品溶液母液分別吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、3 mL 至10 mL 量瓶中，制成5 個不同濃度水平的對照品混合溶液，精密吸取5 個不同濃度的對照品混合溶液10 μL，注入液相色譜，得到各濃度的各色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標，相對應的色譜峰面積為縱坐標建立標準曲線，得出線性關系及范圍。金絲桃苷線性關系回歸方程Y=0.4009X+0.0386（R2=0.9999），線性范圍為11.907～119.07 μg/mL；紫云英苷線性關系回歸方程Y=0.3550X+0.0205（R2=1.0000），線性范圍3.7485～56.2275 μg/mL。

圖2 10批菟絲子提取液的HPLC指紋圖譜疊加圖

表3 10批菟絲子提取液的HPLC指紋圖譜相似度評價

2.2.2 精密度試驗

取同一批次的菟絲子提取液（編號：S10），按照1.2.2.3 供試品溶液制備方法制備供試品，按1.2.2.1色譜條件進行連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。金絲桃苷、紫云英苷峰面積的RSD 分別為0.27 %、0.57 %（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗

取同一批次的菟絲子提取液6 份（編號：S10），按照1.2.2.3 供試品溶液制備方法制備供試品，按1.2.2.1 色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果顯示，金絲桃苷、紫云英苷峰面積的RSD 為0.67 %、0.95%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一批次供試品溶液（編號：S10），按1.2.2.1色譜條件分別于0、11 h、13 h、19 h、22 h、28 h進樣，記錄峰面積。結果顯示，金絲桃苷、紫云英苷峰面積的RSD 分別為0.64%、0.57%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置28 h穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率

精密量取已知含量的同一批次的菟絲子提取液（編號：S10）5 mL 至20 mL 量瓶中，共9 份，分別按照提取液中金絲桃苷、紫云英苷含量的50 %、100 %、150 %共3 個水平加入對照品適量，按“1.2.1.2”制備方法進行樣品制備，按照1.2.2.1 色譜條件進行測定，金絲桃苷、紫云英苷加標回收率結果見表4。

由表4 可知，金絲桃苷的加標回收率范圍為91.51 %～99.92 %，平均回收率為95.03 %；紫云英苷加標回收率范圍為94.57 %～101.61 %，平均回收率為98.81%，RSD值分別為3.72%、3.20%。

表4 菟絲子提取液中金絲桃苷、紫云英苷的加標回收率(n=9)

2.2.6 含量測定

精密吸取對照品溶液10 μL，菟絲子提取液供試品溶液10 μL，按照1.2.2.1 色譜條件測定，帶入線性方程計算金絲桃苷及紫云英苷的含量，見表5。

表5 10批菟絲子提取液檢測結果

由表5 可知，10 批菟絲子提取液中金絲桃苷含量范圍為75.5806～106.3686 μg/mL，平均含量為87.5463 μg/mL，紫云英苷含量范圍為14.4058～27.1888 μg/mL，平均含量為20.1103 μg/mL。在這10 批菟絲子提取液中金絲桃苷與紫云英苷含量存在著差異，可能造成的原因為藥材本身的差異性。張燕麗等[3]研究了不同產(chǎn)地菟絲子中6 種主要活性成分含量，其中內(nèi)蒙古地區(qū)種植的菟絲子中金絲桃苷和紫云英苷的含量最高。

3 討論

在預實驗中，對金絲桃苷、紫云英苷對照品在190～400 nm 范圍內(nèi)進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷、紫云英苷在360 nm 處均有較大的吸收峰，且在此波長下各成分之間的干擾較小，基線平穩(wěn)，故選擇360 nm作為檢測波長。

本文通過HPLC 法研究了菟絲子提取液指紋圖譜及金絲桃苷、紫云英苷2 種活性成分的含量，研究結果顯示，10批菟絲子提取液指紋圖譜相似度高于0.95，表明這10批菟絲子提取液具有良好的一致性，其中金絲桃苷平均含量為87.5463 μg/mL，紫云英苷平均含量為20.1103 μg/mL，加標回收率在91.51%～101.61%之間，RSD 值在3.20%～3.72%之間，表明該方法準確度高，穩(wěn)定性好，能夠很好的用于菟絲子提取液指紋圖譜及金絲桃苷、紫云英苷的含量測定，為菟絲子提取液的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。