王俐君，李 坤，高 潔，吳永康，盧志園，顧祎寧，王星禹，王 健，張宗奇，徐 穎＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 上海 201203；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 上海 201203；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腦病科 上海 200021）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是全球普遍的神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的認(rèn)知功能，并且會(huì)造成不可逆的記憶喪失，使其喪失自我照顧管理的能力[1-2]。AD 的主要病理特征是胞外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的沉積形成斑塊和胞內(nèi)tau 蛋白積聚形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)[3-4]。近些年來，越來越多地研究認(rèn)為炎癥在AD 的病理過程中也發(fā)揮著重要的作用[5]，在AD 早期，炎癥反應(yīng)是發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用，但隨著病程的加劇，會(huì)引起炎癥因子的過度產(chǎn)生和腦內(nèi)的持續(xù)炎癥，并加劇神經(jīng)元和突觸的損傷[6]。因此，將神經(jīng)炎癥作為AD 的治療靶點(diǎn)是一種很有前景的治療策略。

早老素1/2 條件性雙基因敲除（Presenilin1/2 conditional double knockout，PS cDKO）小鼠是 AD 樣的小鼠模型。PS1 和PS2 基因突變是早發(fā)性家族性AD的主要致病原因[7]，這2 種基因編碼的跨膜蛋白具有67%相同的氨基酸序列，只是在N-末端和第六疏水環(huán)不同，是γ-分泌酶的亞基，參與β淀粉樣前體蛋白、Notch受體等蛋白的酶解過程[8]。PS cDKO小鼠表現(xiàn)出一系列的年齡依賴的AD樣表型，像突觸功能異常、tau蛋白的高度磷酸化、腦萎縮、認(rèn)知功能異常和炎癥反應(yīng)的增加[9-10]。對于炎癥反應(yīng)，不僅出現(xiàn)在腦中，也會(huì)擴(kuò)散到周圍，這有助于探究炎癥反應(yīng)在AD 病理過程的發(fā)揮的作用[11]。

對于AD 的治療，目前FDA 批準(zhǔn)的藥物有美金剛、多奈哌齊、加蘭他敏和利維思明，并且以Aβ和tau蛋白為靶點(diǎn)的疾病修飾治療研究取得的成果有限，目前沒有很強(qiáng)的臨床和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[12]。慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致tau 蛋白的過度磷酸化、突觸蛋白丟失進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能受損[13]。以慢性炎癥為作用靶點(diǎn)，尋找防治AD 的天然藥物，為AD 的防治提供新的治療策略。反式桂皮醛（Trans-cinnamaldehyde，TCA）是肉桂油中的主要活性成分，可以發(fā)揮抗癌、抗炎、殺菌、保護(hù)心臟和抗氧化等作用[14-15]。對于TCA 的神經(jīng)保護(hù)作用，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，對于脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，TCA 預(yù)處理能夠減弱其形態(tài)改變、減少一氧化氮和白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的釋放、通過縮短誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA 的半衰期來阻斷LPS 誘導(dǎo)的iNOS 表達(dá)，并且對于LPS 刺激的小鼠，TCA 對其的識(shí)別記憶和空間參考記憶有改善作用，這是通過改善突觸可塑性、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、降低 iNOS 和 IL-1β的 mRNA 水平，下調(diào) iNOS 的表達(dá)和阻斷胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（Extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2）的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的[16]。另外，對于6月齡的PS cDKO 小鼠，TCA 通過阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和神經(jīng)炎癥和改善突觸功能障礙來改善受損的記憶功能[17]。AD 是進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為逐漸惡化的認(rèn)知功能障礙和行為異常，其中記憶（屬于認(rèn)知范疇）障礙被認(rèn)為是主要癥狀[18]。TCA 可以改善6 月齡 PS cDKO 小鼠的記憶功能障礙，對于12月齡的PS cDKO 小鼠的記憶功能障礙是否仍具有改善作用目前尚不清楚。為了檢測TCA改善記憶障礙的治療潛能，本研究進(jìn)一步探索TCA 對于AD 的防治作用，借助12 月齡的老年P(guān)S cDKO 小鼠作為AD 模型小鼠，探討TCA 對小鼠運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶、空間識(shí)別記憶的影響；探討TCA 對突觸蛋白和促炎癥因子的影響來進(jìn)行機(jī)制的探討，為臨床防治AD提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

對于PS cDKO 小鼠的繁殖和鑒定方法同文獻(xiàn)[7]。攜帶轉(zhuǎn)基因 Cre，PS1 和 PS2 的基因型為 fPS1/fPS1、PS2-/-的 PS cDKO 小鼠作為 PS cDKO 小鼠；野生型對照小鼠組選用的是遺傳背景、年齡均相同的同窩小鼠（不攜帶 Cre 基因，PS1 和 PS2 的基因型為 fPS1/+、PS2+/+或者fPS1/+、PS2+/-）。所有小鼠均飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級動(dòng)物房間，飼養(yǎng)溫度為（22±2）°C，明暗周期為12 h，可自由飲食。對于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行的所有操作都遵守倫理規(guī)定，經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。9 月齡的PS cDKO 小鼠和其同窩小鼠隨機(jī)分為4 組：野生型組（Wildtype，WT）、野生型 +TCA組（WT+TCA）、模型組（PS cDKO，cDKO）和模型 +TCA 組（cDKO+TCA），每組 15 只。WT + TCA 和 cDKO + TCA 組的小鼠給予含有TCA（240 ppm）的飼料治療，WT 和cDKO 組的小鼠給予普通飼料，共治療90 天。第60 天開始進(jìn)行行為學(xué)測試，行為學(xué)測試期間繼續(xù)如前給予TCA治療。

1.2 主要儀器及試劑

電子天平（上海光能儀器廠）；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Rad 公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能公司）；PCR 儀（瑞士Roche 公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；TCA（Sigma-Aldrich 公司）；BCA 試劑盒（碧云天公司）；N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate Receptor，NMDAR）亞基NR1、磷酸化的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II alpha（Phosphorylated-Ca/calmodulin-dependent protein kinases II alpha，pαCaMKII）、β-actin 抗體和 HRP 標(biāo)記的抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司）；PCR 試劑盒（TaKaRa 公司）；小鼠IL-1βELISA試劑盒（R&D Systems公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 曠場實(shí)驗(yàn)

將小鼠放到曠場箱中，讓其自由探索15 min，觀察其自主運(yùn)動(dòng)能力，記錄其總共移動(dòng)的距離、速度和持續(xù)時(shí)間。另外，將其在邊緣區(qū)域移動(dòng)時(shí)間的百分比作為衡量小鼠焦慮樣行為的一個(gè)指標(biāo)。

1.3.2 新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前，將小鼠放到曠場箱中適應(yīng)3 天。之后進(jìn)行測試，在訓(xùn)練階段，在曠場箱中放置2 個(gè)顏色、形狀一樣的物體，讓小鼠自由探索15 min。訓(xùn)練1 h后，將其中1個(gè)物體換成顏色和形狀不同的物體，讓小鼠自由探索15 min；訓(xùn)練24 h后，重復(fù)訓(xùn)練1 h的操作，記錄小鼠探索2 個(gè)物體的時(shí)間。計(jì)算探索任一物體（訓(xùn)練階段）或新物體（測試階段）的時(shí)間占探索2個(gè)物體總時(shí)間的百分比作為偏好指數(shù)（Preference index）來作為衡量學(xué)習(xí)記憶的指標(biāo)。

1.3.3 Y迷宮實(shí)驗(yàn)

Y 迷宮包括3 個(gè)臂，臂與臂之間的角度為120°。在訓(xùn)練階段，用擋板堵住其中的1個(gè)臂，讓小鼠自由探索另外 2 個(gè)臂 8 min，1 h 后，撤掉擋板，開放第 3 個(gè)臂（稱為新臂），讓小鼠自由探索3個(gè)臂，記錄其進(jìn)入新臂的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間，來評估小鼠的空間記憶。

1.3.4 Western Blot 檢測突觸蛋白的表達(dá)水平

取（25-40）mg 小鼠前額皮質(zhì)加入到預(yù)冷的200 μL 裂解液中，在研磨儀中研磨1 min，之后4℃離心（12000 rpm，10 min），得到蛋白原液。用借助BCA蛋白定量法對蛋白原液進(jìn)行蛋白定量后，將蛋白濃度定到40 μg·10 μL-1這一標(biāo)準(zhǔn)，之后對蛋白進(jìn)行變性，得到上樣樣品。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜的過程，得到轉(zhuǎn)印了蛋白的NC 膜，用5%的脫脂奶粉（目的蛋白：NR1；βactin）或 5% BSA（目的蛋白：p-αCaMKII）室溫封閉1 h，4℃孵 NR1 一抗（1∶1000）、p-αCaMKII 一抗（1∶1000）和β-actin 一抗（1∶1000），過夜，將膜放在搖床上用TBST 洗3 遍，每次10 min，搖床轉(zhuǎn)速（90-100）rpm，之后孵 HRP 標(biāo)記的二抗（1∶3000），孵育 1 h，再用TBST洗3遍，每次10 min，搖床轉(zhuǎn)速（90-100）rpm。待涂勻發(fā)光液后，放入成像儀中成像。得到的圖片借助Image J軟件進(jìn)行灰度值的測定。

1.3.5 qRT-PCR檢測IL-1β的mRNA水平

?。?0-80）mg的小鼠前額皮質(zhì)加入到1 mL Trizol中，之后研磨1 min，插入冰中，加入200 μL 氯仿，冰上靜置后離心，取400 μL上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后與冰上靜置，之后離心，倒掉上清，加入75%乙醇（DEPC 水配制）后離心，倒掉上清，倒扣晾干，加入20 μL DEPC 水溶解，用酶標(biāo)儀測得濃度和純度，得到總RNA。借助逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再用PCR試劑盒配成10 μL體系，IL-1β引物序列為：Forward：CAGGCAGGCAGTATCACTCA；Reverse：AGCTCATATGGGTCCGACAT。在 PCR 儀中擴(kuò)增，進(jìn)而獲得Ct值，并計(jì)算2-△△Ct值作為基因的相對表達(dá)量。

1.3.6 ELISA檢測IL-1β的含量

取40 mg 小鼠前額皮質(zhì)加入到200 μL 預(yù)冷的0.9% 的 氯 化 鈉 中 ，進(jìn) 行 研 磨 1 min，4℃ 離 心（12000 rpm，10 min），獲得原液，借助BCA 蛋白定量法進(jìn)行定量，確定上樣量。之后根據(jù)ELISA 試劑盒的說明書進(jìn)行逐步操作，計(jì)算出IL-1β的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS Statistics 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用X±S.E.M.表示，4 組間比較采用one-way ANOVA 分析，多重比較采用 LSD 檢驗(yàn)，將P＜ 0.05 視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCA對PS cDKO小鼠的運(yùn)動(dòng)能力沒有影響

在曠場實(shí)驗(yàn)中，相較于WT 小鼠，PS cDKO 小鼠在曠場箱中移動(dòng)的距離更長（P＜0.001），且速度更快（P＜ 0.001），表明PS cDKO 小鼠呈現(xiàn)高度活躍狀態(tài)，但TCA 治療后不影響PS cDKO 小鼠移動(dòng)的距離和速度；此外，4組小鼠的邊緣區(qū)時(shí)間百分比沒有顯著差異（圖1）。以上結(jié)果表明TCA 對PS cDKO 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力沒有影響。

2.2 TCA改善PS cDKO小鼠的短時(shí)辨識(shí)記憶障礙

圖1 TCA不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力

圖2 TCA改善小鼠的短時(shí)辨識(shí)記憶

新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中（圖2），在訓(xùn)練階段，4 組小鼠的對于物體偏好性沒有明顯差異，在1 h 測試階段，與WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠探索新物體的時(shí)間明顯減少（P＜ 0.01），這表明PS cDKO 小鼠短時(shí)辨識(shí)記憶受損，而TCA 治療后，PS cDKO 小鼠探索新物體的時(shí)間明顯增加（P＜0.05），這表明TCA 可以改善PS cDKO 小鼠受損的短時(shí)辨識(shí)記憶。然而，在24 h 測試階段，WT組小鼠探索新物體的時(shí)間明顯長于cDKO 組的小鼠（P＜ 0.05），這表明PS cDKO 小鼠長時(shí)記憶能力也受損，但TCA 干預(yù)后對其沒有顯著影響。另外，進(jìn)行組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，cDKO+TCA 組的小鼠在1 h 測試階段對于新物體的偏好性明顯高于訓(xùn)練階段（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，TCA 改善PS cDKO 小鼠受損的短時(shí)辨識(shí)記憶，但對其受損的長時(shí)記憶沒有顯著性影響。

2.3 TCA改善PS cDKO小鼠的空間記憶障礙

在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中（圖3），在1 h測試階段，與WT組小鼠相比，PS cDKO 小鼠進(jìn)入新臂的時(shí)間和次數(shù)明顯減少（P＜ 0.001），提示PS cDKO 小鼠表現(xiàn)出空間記憶障礙，而TCA 治療后，PS cDKO 小鼠進(jìn)入新臂的時(shí)間和次數(shù)明顯增加（P＜0.001），這表明TCA 可以改善PS cDKO小鼠的空間記憶障礙。

2.4 TCA 上調(diào)PS cDKO 小鼠前額皮質(zhì)中突觸蛋白（NR1、p-αCaMKII）的表達(dá)

NMDAR 在突觸功能、可塑性和神經(jīng)元存活中發(fā)揮重要作用，其中，NR1 是NMDAR 的一個(gè)亞基，αCaMKII 是 NMDAR 的下游分子[19]。與 WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠前額皮質(zhì)中 NR1 和 p-αCaMKII 蛋白的表達(dá)明顯減少（P＜ 0.001，P＜ 0.05）；經(jīng)過TCA 的介入治療后明顯上調(diào)這2 種突觸蛋白的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），這表明TCA 可能發(fā)揮改善突觸功能障礙的作用（圖4）。

2.5 TCA 抑 制 PS cDKO 小 鼠 前 額 皮 質(zhì) 中 IL-1β 的產(chǎn)生

與WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠前額皮質(zhì)中的IL-1β的 mRNA 水平明顯升高（P＜ 0.001），TCA 介入后，可以明顯下調(diào)IL-1β的mRNA 水平（P＜ 0.001）（圖5）。ELISA 檢測也得到了一致的結(jié)論，與WT 組小鼠相比，PS cDKO 小鼠前額皮質(zhì)中的IL-1β的含量明顯增多（P＜ 0.01），TCA 治療后，可以明顯降低IL-1β的含量（P＜0.05）。無論是從mRNA水平還是蛋白水平，TCA 都可以抑制 PS cDKO 小鼠中增高的 IL-1β，從而減少IL-1β的產(chǎn)生。

圖3 TCA改善小鼠的空間記憶障礙

圖4 TCA上調(diào)PS cDKO小鼠前額皮質(zhì)NR1和p-αCaMKII蛋白的表達(dá)

圖5 TCA抑制PS cDKO小鼠前額皮質(zhì)IL-1β的產(chǎn)生

3 討論

AD 病理過程錯(cuò)綜復(fù)雜，提出的機(jī)制假說也很多，但是目前尚未出現(xiàn)令人滿意的治療藥物。近些年來，神經(jīng)炎癥在AD 病理過程中發(fā)揮的作用越來越受到重視，一些流行病學(xué)的研究也建議使用抗炎藥物減少AD 的發(fā)病率[5]。慢性炎癥會(huì)促進(jìn)突觸和神經(jīng)元的丟失、影響突觸可塑性、促進(jìn)tau 蛋白的磷酸化和損害認(rèn)知功能[13]。并且在AD 患者的額葉皮質(zhì)發(fā)現(xiàn)炎癥水平的上調(diào)，另外，tau蛋白的磷酸化與炎癥水平成正相關(guān)，與突觸密度呈負(fù)相關(guān)[20]。在慢性炎癥的過程中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放促炎因子，如：IL-1β和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，過度和大量釋放的促炎因子對腦功能造成損傷[5]。另外，在去世的AD 患者的腦中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎介質(zhì)水平的增高，并且AD 模型小鼠也支持慢性炎癥在AD病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用[21]。

對于TCA 這一藥物，本實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)現(xiàn)其可以通過阻斷6 月齡的PS cDKO 小鼠的NF-κB 信號(hào)通路來抑制神經(jīng)炎癥，從而改善NMDA 受體的功能障礙、突觸功能障礙和小鼠的記憶能力[17]。由于PS cDKO 的AD 樣表型是年齡依賴性的，那么，對于12 月齡的PS cDKO 小鼠，TCA 是否還具有治療效果，本次研究進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)TCA 仍具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。在行為學(xué)方面，和6月齡的PS cDKO 小鼠相似的是，12月齡PS cDKO 小鼠依然表現(xiàn)出短時(shí)辨識(shí)記憶和空間記憶受損。不同的是，在新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)24 h 的測試中，12 月齡的PS cDKO 小鼠表現(xiàn)出了探索新物體的時(shí)間顯著低于WT 組的小鼠，表明其具有長時(shí)記憶能力障礙，這與之前的研究報(bào)道結(jié)論是一致的[22]。經(jīng)過為期3 個(gè)月的TCA 干預(yù)，可以改善PS cDKO 小鼠受損的短時(shí)辨識(shí)記憶和空間記憶，但長時(shí)記憶能力障礙沒有影響。

NMDAR 為谷氨酸門控離子通道型受體，對Ca2+和Ca2+內(nèi)流具有很高的滲透性，這是突觸形成的必要條件[23]，其在學(xué)習(xí)記憶的過程中發(fā)揮重要作用[24]。NMDAR 亞基包括 NR1、NR2（A-D）和 NR3（A、B），并且其功能異常與AD 密切相關(guān)[25]。CaMKII 是一種突觸蛋白，在NMDAR 參與的Ca2+內(nèi)流誘導(dǎo)的長時(shí)程增強(qiáng)中被激活[26]，其和NMDAR 是突觸可塑性（長時(shí)程增強(qiáng)和長時(shí)程抑制）的中心介質(zhì)，而突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)[27]。在12 月齡的PS cDKO 小鼠的前額皮質(zhì)中，NR1 和 p-αCaMKII 這 2 種蛋白的表達(dá)是明顯降低的，而TCA 能夠上調(diào)這2 種突觸蛋白的表達(dá)水平。但是我們以前的研究中TCA對于6月齡的PS cDKO小鼠前額皮質(zhì)中的表達(dá)水平減少的NR1 蛋白沒有明顯的改善作用[17]。IL-1β是一種促炎癥因子，其過度產(chǎn)生會(huì)使神經(jīng)元可塑性和記憶功能受損[28]，相較于WT 組的小鼠，12 月齡的 PS cDKO 小鼠前額皮質(zhì)中 IL-1β的mRNA 水平和蛋白水平明顯升高，而TCA 的介入可以明顯抑制IL-1β的產(chǎn)生。

根據(jù)目前的結(jié)果，無論是6月齡還是12月齡的PS cDKO 小鼠，TCA 都能夠發(fā)揮抑制促炎癥因子IL-1β產(chǎn)生、上調(diào)NR1 和p-αCaMKII 突觸蛋白的表達(dá)和改善短時(shí)記憶和空間識(shí)別記憶障礙的作用。但是TCA 對于12 月齡PS cDKO 小鼠其它的突觸蛋白和促炎癥介質(zhì)（如：TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2）是否會(huì)有影響，以及通過哪條信號(hào)通路發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步地探索。

綜上所述，TCA 能夠抑制前額皮質(zhì)促炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生、上調(diào)突觸蛋白的表達(dá)和改善PS cDKO AD 樣小鼠的記憶障礙，具有一定的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，對于其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究，為臨床研究提供可供參考的治療思路。