張學(xué)松，楊陳陽，陶娟

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013）

金屬-有機框架材料(MOFs)是由有機配體與金屬離子或團簇通過配位鍵自組裝而成的一種新型的有機-無機雜化晶態(tài)多孔材料，具有高孔隙率、大比表面積、孔徑可調(diào)及可裁剪性等優(yōu)勢，已成為現(xiàn)代化學(xué)和材料領(lǐng)域的一大研究熱點。

目前采用MOFs作為纖維素酶載體的文獻報道中，其固定化方法主要以物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法及化學(xué)交聯(lián)法為主，本研究首次采用原位封裝法，即在MOFs材料制備過程中預(yù)先加入纖維素酶，最終酶被包封在MOFs框架內(nèi)，形成牢固結(jié)合的固定化酶，纖維素酶@MOFs。該包封型固定化酶不僅能提高纖維素酶的穩(wěn)定性，顯著減少由于酶的脫附引起整體酶活性的降低；同時酶的固定不再局限于載體表面，還可被封裝在MOFs框架內(nèi)，從而極大地提高了酶的負(fù)載量?？讖綑z測的結(jié)果可進一步驗證纖維素酶在MOFs中的分布。本研究還對纖維素酶@MOFs的穩(wěn)定性進行了評價。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

RCT型IKA磁力攪拌器(江西鼎技科學(xué)儀器有限公司)；TF-FD-1型冷凍干燥機（上海田楓實業(yè)有限公司）；UV-5200PC型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Autosorb IQASIQ型物理吸附儀（美國quantachrome公司）。

纖維素酶、2-甲基咪唑（2-mIm）、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、考馬斯亮藍G-250（分析純，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司）；乙酸鋅(Zn(CH3COO)2)（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2 纖維素酶@ZIF-8的制備

本研究以鋅基MOFs，沸石咪唑框架材料-8(ZIF-8)，作為纖維素酶的固定化載體，制備方法參考文獻Wu等(2019)[1]并略做改動，首先稱取0.6856 g Zn(CH3COO)2溶于300 mL去離子水中得溶液A；稱取0.984 g 2-mIm溶于300 mL去離子水中得溶液B；稱取纖維素酶粉0.20 g溶于25 mL緩沖溶液（pH 4.8,0.1 M）中得溶液C。將上述溶液A,C逐滴加至溶液B中，室溫下攪拌反應(yīng)12h，過濾，去離子水洗滌三次，除去未反應(yīng)的分子。產(chǎn)品在真空條件下冷凍干燥24 h，制得纖維素酶@ZIF-8。

1.3 纖維素酶負(fù)載量的測定

采用考馬斯亮藍法[2]通過測定纖維素酶中蛋白質(zhì)的含量來確定纖維素酶的質(zhì)量。最終纖維素酶負(fù)載量用下式表示：

其中，M0為纖維素酶的初始加入質(zhì)量，mg；M1為未被固定的纖維素酶的質(zhì)量，即反應(yīng)上清液中游離纖維素酶的質(zhì)量，mg；M為載體ZIF-8的質(zhì)量，g。

1.4 纖維素酶@ZIF-8的活性評價

采用羧甲基纖維素法測定纖維素酶的活性，首先量取2 mL CMC-Na至反應(yīng)管中，加0.5 mL纖維素酶液混勻，40℃下?lián)u床反應(yīng)30 min。之后加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸顯色劑（DNS），沸水浴加熱5 min滅活，冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，540nm測光密度值。本研究以40℃、pH4.5最適反應(yīng)條件下，纖維素酶的活性作為計算標(biāo)準(zhǔn)，纖維素酶@ZIF-8的酶活性均以相對活性表示。

1.5 纖維素酶@ZIF-8的孔徑測定

纖維素酶@ZIF-8的孔徑分布采用美國Quantachrome公司生產(chǎn)的Quantachrome Autosorb-IQASIQ物理吸附儀進行表征，由非局域密度泛函理論（NLDFT）計算得到，并在77K條件下測定了氮氣吸附脫附等溫線。樣品在進行氮氣物理吸附前在200℃脫氣10 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶@ZIF-8中酶的負(fù)載量

本研究在ZIF-8的制備過程中添加了不同比例的纖維素酶進行原位封裝，結(jié)果顯示，隨著初始纖維素酶加入量的增加，纖維素酶@ZIF-8中酶的負(fù)載量也隨之增加，當(dāng)纖維素酶的加入量為ZIF-8質(zhì)量的50%時，酶的負(fù)載量達到最高值為350mg/g。相比吸附法或交聯(lián)法制備的固定化纖維素酶[3]，原位封裝法可獲得較高的酶負(fù)載量，這是由于纖維素酶的固定不再局限于MOFs載體的表面，還可被封裝在MOFs框架內(nèi)，從而極大地提高了酶的負(fù)載量，同時固定化酶的比酶活性也隨之提高。

2.2 纖維素酶@ZIF-8的穩(wěn)定性

本研究對比了纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在pH 3~8反應(yīng)條件下的相對酶活性，結(jié)果如圖1所示。纖維素酶的最佳pH值為4.5，隨著pH值的增大，酶活性迅速下降，當(dāng)pH為8時，相對酶活性僅為最佳條件時的10%；纖維素酶@ZIF-8的最佳pH值為5，并在pH5~8的環(huán)境下保持較高的酶活性，特別是在pH8反應(yīng)條件下中，仍能保持65%的相對酶活性。固定后的纖維素酶@ZIF-8表現(xiàn)出更好的堿性耐受性，可能是ZIF-8本身在堿性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對纖維素酶蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化起到了一定保護作用。

圖1纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在不同pH反應(yīng)條件下的相對酶活性

本研究還對比了纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在不同反應(yīng)溫度下的相對活性，結(jié)果如圖2所示。纖維素酶在40℃時活性最高，隨著溫度升高，活性逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)溫度為80℃時，相對酶活性為85%。纖維素酶@ZIF-8的最佳反應(yīng)溫度為50℃，酶活性也隨溫度升高緩慢降低，在80℃反應(yīng)條件下，相對酶活性為88%。固定后的纖維素酶@ZIF-8最佳反應(yīng)溫度比固定前提高了10℃，可能是ZIF-8對纖維素酶的包封，限制了纖維素酶的蛋白質(zhì)在加熱過程中的遷移率和構(gòu)象的變化，所以，纖維素酶@ZIF-8的溫度耐受性隨之提高。

圖2 纖維素酶與纖維素酶@ZIF-8在不同反應(yīng)溫度下的相對酶活性

2.3 纖維素酶@ZIF-8的孔徑分布

圖3 纖維素酶@ZIF-8的孔徑分布圖

圖4 纖維素酶@ZIF-8的N2吸附-脫附等溫線

從圖3孔徑分布圖中可以看出：纖維素酶@ZIF-8的孔徑均為大于2 nm的介孔結(jié)構(gòu)。圖4為氮氣吸附-脫附等溫線，在中壓（0.3~0.8）范圍內(nèi)，吸附曲線緩慢上升，并且存在一個后滯環(huán)，同樣說明介孔結(jié)構(gòu)的存在。由于ZIF-8本身的孔徑分布在0.34~1.1 nm[4]之間，屬于典型的微孔MOFs，纖維素酶的引入，導(dǎo)致ZIF-8在組裝過程中形成了缺陷，從而使得孔徑變大得到介孔結(jié)構(gòu)，由此進一步證明了纖維素酶被有效地封裝在了ZIF-8的框架內(nèi)，制得包封型固定化酶。

3 結(jié)論

采用原位封裝法在ZIF-8的制備過程中引入纖維素酶，最終酶被包封在ZIF-8的框架內(nèi)，得到纖維素酶@ZIF-8，該固定化酶具有結(jié)合牢固、負(fù)載量高、對堿耐受性良好等優(yōu)點。同時纖維素酶的引入導(dǎo)致ZIF-8的微孔結(jié)構(gòu)產(chǎn)生缺陷進而形成介孔結(jié)構(gòu)，更加有利于底物和產(chǎn)物的自由擴散，為后續(xù)纖維素的酶催化反應(yīng)提供廣闊的應(yīng)用前景。