邰小華 馮聯(lián)忠 章波 張斌忠 李斌 王胤達(dá)

近年來(lái)，circRNAs 被廣泛報(bào)道其作為促癌基因或抑癌基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[1]，例如circ_OSBPL10[2]、circ_006100[3]和circ_SERPINE2[4]可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Tian 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，circ_0003159 在胃癌組織中低表達(dá)，且低表達(dá)circ_0003159 與胃癌轉(zhuǎn)移和腫瘤大小呈正相關(guān)。此外，circRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[6]。starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，miR-32-5p 作為促癌基因以及circ_0003159 的潛在靶基因之一，在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)[7-8]。同時(shí)，第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）作為miR-32-5p 的潛在靶基因之一，過(guò)表達(dá)PTEN 可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[9]。然而，目前circ_0003159/miR-32-5p/PTEN 分子軸調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬探討circ_0003159 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響以及其潛在作用機(jī)制，以期為胃癌早期診斷和臨床治療提供潛在的生物分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2015 年6 月至2018 年12 月嘉興市第二醫(yī)院腫瘤外科經(jīng)手術(shù)切除的30 例患者的胃癌組織和配對(duì)的癌旁組織（距離腫瘤≥5 cm）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)X 線鋇餐、腹部超聲、螺旋CT 與正電子發(fā)射成像、腫瘤標(biāo)志物以及病理學(xué)檢查確診為胃癌；（2）術(shù)前未經(jīng)放療、化療以及免疫治療；（3）患者沒(méi)有其他的重大疾病。手術(shù)前均告知患者并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 人胃癌細(xì)胞系（BGC823、AGS、MKN45）以及人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（500 ml，批號(hào)：11965-092）、胰蛋白酶（500 ml，批號(hào)：25200072）和FBS（500 ml，批號(hào)：10100）均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；青霉素和鏈霉素均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（100 ml，批 號(hào)：C0222）；Trizol 試 劑 購(gòu) 自 美 國(guó)Invitrogen 公 司（200 ml，批號(hào)：15596018）；circ_0003159 模擬物（pcDNA3.1-circ_0003159）、空載體陰性對(duì)照物（pcDNA3.1-NC）、miR-32-5p 模擬物（miR-32-5p mimic）及空載體對(duì)照物（mimic-NC）均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000 購(gòu)自北京BioTeKe 公司（批號(hào)：BP2041）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：KGA1311）；CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司（批號(hào)：CK04）；Transwell 小室（批號(hào)：3422）和Matrigel（批號(hào)：354234）均購(gòu)自美國(guó)康寧公司；兔抗人PTEN（批號(hào)：9188）、β-actin 單克隆抗體（批號(hào)：4970）和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）山羊抗鼠IgG（批號(hào)：7077）均購(gòu)自美國(guó)Cell signaling Technology 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司（1 000 ml，批號(hào)：23229）；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司（批號(hào)：LF103）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 采用含有10%FBS 和雙抗（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系和人胃黏膜上皮細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待BGC823 細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，采用胰酶消化細(xì)胞，并將收集到的細(xì)胞于2×105個(gè)/孔的濃度接種到6 孔板中，同時(shí)將BGC823 細(xì)胞分為以下組別：circ_0003159 超表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-circ_0003159）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC）、過(guò)表達(dá)miR-32-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-32-5p mimic）及對(duì)照組（轉(zhuǎn)染mimic-NC）。轉(zhuǎn)染時(shí)嚴(yán)格參照LipofectamineTM 3000試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，并將上述載體轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，并繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，更換正常培養(yǎng)基DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 circ_0003159、PTEN 和miR-32-5p 的相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。收集人胃癌組織、癌旁組織、生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期胃癌細(xì)胞BGC823、AGS、MKN45 以及正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，采用TRIzol 提取組織和細(xì)胞中總RNA，并采用NanoDrop 檢測(cè)RNA 的濃度。隨后，采用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照qPCR 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)circ_0003159 和miR-32-5p 的mRNA 表達(dá)水平，以U6 作為miR-32-5p 的內(nèi)參，以及GAPDH 作為circ_0003159 和PTEN 的內(nèi)參。circ_0003159 上游引物為5'-ACTGGGAATGGAGGAAGA-3'，下游引物為5'-TGAGAAAGGATTGAGGGAAAAG - 3' ；GAPDH 上 游 引 物 為5' - AAGCCACCC－CACTTCTCTCTAA-3'，下游為5'-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT -3'；PTEN 上 游 引 物 為 5' -ACCAGTGGCACTGTTGTTTCAC-3'，下游引物為5'-TTCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3'；miR-32-5p 上 游 引 物 為5'-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3'，下游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；U6 上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8 法。將轉(zhuǎn)染后的circ_0003159 超表達(dá)組和陰性對(duì)照組中BGC823 細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中，并在沒(méi)孔中加入100 μl DMEM 培養(yǎng)基，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48和72 h 后，向每孔中加入10 μl CCK-8 溶液（0.5 mg/ml）后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的每孔光密度（OD450）值，并計(jì)算平均值。

1.6 細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測(cè) 采用Transwell 小室試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的circ_0003159 超表達(dá)組和陰性對(duì)照組中BGC823 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的濃度接種于Transwell 小室上室，下室加入500 μl DMEM 培養(yǎng)基后常規(guī)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)激素后采用1%結(jié)晶紫染色20 min，并于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野計(jì)算侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算平均值。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，Transwell 小室上室需采用Matrigel 膠包被，其他實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)步驟一致。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)miR-32-5p 組和對(duì)照組中BGC823 細(xì)胞，以1×106個(gè)/ml 的濃度接種于12 孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，采用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑，將miR-32-5p mimic 轉(zhuǎn)染至過(guò)表達(dá)miR-32-5p 組，將mimic-NC轉(zhuǎn)染至對(duì)照組，另外將pGL3 空白質(zhì)粒、circ_0003159 3'-UTR 突變型（MUT）質(zhì)?；騊TEN 3'-UTR MUT 質(zhì)粒、circ_0003159 3'-UTR 野生型（WT）質(zhì)?；騊TEN 3'-UTR WT 型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至兩組細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)36 h。加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，并于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行熒光素酶活力值檢測(cè)。

1.8 PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。采用RAPI 裂解液提取過(guò)表達(dá)miR-32-5p 組和對(duì)照組BGC823 細(xì)胞中的總蛋白。隨后，根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)提取到的蛋白質(zhì)濃度。然后，進(jìn)行10% SDSPAGE 分離蛋白、電轉(zhuǎn)膜法將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上、以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。其次，分別加入兔抗人PTEN（1∶1 000）和β-actin 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。之后，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育2 h。最后，進(jìn)行ECL 染色，凝膠成像儀采集圖像；通過(guò)Image J 分析灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，并采用GraphPad Prism 8 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌組織及其癌旁組織中circ_0003159、PTEN和miR-32-5p 相對(duì)表達(dá)水平比較 胃癌組織中circ_0003159 和PTEN 的相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于癌旁組織（均P＜0.05），但胃癌組織中miR-32-5p 的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 circ_0003159、PTEN 和miR-32-5p 在胃癌組織及其癌旁組織中相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 4 種細(xì)胞中circ_0003159 相對(duì)表達(dá)水平比較 胃癌細(xì)胞系BGC823、AGS、MKN45 中circ_0003159 的相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（均P＜0.05），且BGC823 細(xì)胞中circ_0003159 的相對(duì)表達(dá)水平最低，見(jiàn)表2。

表2 4 種細(xì)胞系中circ_0003159 相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力比較 相比于陰性對(duì)照組，circ_0003159 超表達(dá)組在48、72 h 時(shí)OD450 均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力比較

2.4 兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與陰性對(duì)照組比較，circ_0003159 超表達(dá)組中細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移數(shù)均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲和遷移能力比較（個(gè)）

2.5 circ_0003159 和miR-32-5p 靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 預(yù)測(cè)結(jié)果可知miR-32-5p 為circ_0003159 潛在的靶基因，PTEN 是miR-32-5p 潛在的靶基因，見(jiàn)圖1。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)miR-32-5p 組中circ_0003159-MUT 和PTEN-MUT 相對(duì)活力值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），而circ_0003159-WT 和PTEN-WT 相對(duì)活力值均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

圖1 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果（a：miR-32-5p 與circ_0003159；b：miR-32-5p 與PTEN；PTEN 為磷酸酶及張力蛋白同源基因）

2.6 兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-32-5p 組中PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)表6、圖2。

3 討論

近年來(lái)，非編碼RNA（circRNA、lncRNA 和miRNA）被廣泛報(bào)道可作為包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志物[10]，例如circ_0000467[11]、circ_0000592[12]和circ_0000190[13]可作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物。同時(shí)，多種circRNAs 通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[14]。例如，Liu等[15]研究表明，circ_0009910 在胃癌組織中高表達(dá)，且高水平的circ_0009910 與較差的生存期呈正相關(guān)；過(guò)表達(dá)circ_101882 可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]；過(guò)表達(dá)circ_104916 可抑制胃癌BGC823 和MGC803 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[17]；本研究亦發(fā)現(xiàn)，circ_0003159在胃癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circ_0003159 可顯著抑制胃癌BGC823 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。

circRNA 通過(guò)靶向結(jié)合下游miRNA 并介導(dǎo)mRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Wang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，circ_EIF4G3 可通過(guò)靶向下調(diào)miR-335 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Li 等[19]研究證實(shí)，circ_0056618 可通過(guò)下調(diào)miR-206 的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌增殖和轉(zhuǎn)移。Sun 等[20]研究表明，circ_SFMBT2 可通過(guò)靶向下調(diào)miR-182-5p 對(duì)CREB1 表達(dá)的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。胃癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)的circ_0027599 和PHDLA1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-101 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[21]。本研究結(jié)果表明，circ_0003159 通過(guò)靶向下調(diào)miR-32-5p 對(duì)PTEN 表達(dá)的抑制作用，可抑制BGC823細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。此外，miR-32-5p 被報(bào)道在多種惡性腫瘤中其作為促癌基因，通過(guò)敲降miR-32-5p可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9，22]。Yan 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-32-5p 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p在胃癌組織中高表達(dá)。

表5 兩組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活力值比較

表6 兩組細(xì)胞PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2 2 組細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)的電泳圖（PTEN 為磷酸酶及張力蛋白同源基因）

大量研究證實(shí)，PTEN 作為抑癌基因在多種腫瘤組織和癌細(xì)胞系中低表達(dá)[24-25]。過(guò)表達(dá)PTEN 可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[26]。此外，也有研究證實(shí)，PTEN 可通過(guò)阻斷PI3K/Akt 通路抑制惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為[27]，例如Liu 等[28]研究表明，PTEN 通過(guò)阻斷PI3K/Akt 通路抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。Gao 等[9]研究證實(shí)，miR-32-5p 通過(guò)靶向PTEN 促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。同時(shí)本研究亦證實(shí)PTEN 可作為miR-32-5p的靶基因。

綜上所述，本研究證實(shí)circ_0003159 在胃癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circ_0003159 可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。同時(shí)，circ_0003159 可通過(guò)靶向下調(diào)miR-32-5p 對(duì)PTEN 的表達(dá)。希望通過(guò)本研究可以為臨床上治療胃癌提供潛在的分子標(biāo)志物及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。