劉英梟，袁小紅

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621000）

刺梨（Rosa roxbunghii Tratt.）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，又名山王果、刺莓果、茨梨等，是一種滋補(bǔ)養(yǎng)身、稀有的營(yíng)養(yǎng)珍果［1-3］。刺梨作為貴州省特色食品資源，含有豐富的維生素、黃酮、三萜、多糖類化合物。每100 g 刺梨果肉中含有2 500 mg左右的維生素C，是蘋果、梨等含量的500 倍，被稱作“VC 之王”［4］。有研究表明，野生刺梨中總黃酮含量為0.746%，總?cè)坪繛?.578%［5］。貴州省刺梨集中連片種植面積約10 萬(wàn)hm2，種植規(guī)模全國(guó)第一。據(jù)貴州日?qǐng)?bào)報(bào)道，貴州省預(yù)計(jì)到2021 年刺梨種植面積在現(xiàn)有基礎(chǔ)上將新增4 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)鮮果50 萬(wàn)t，綜合產(chǎn)值達(dá)到100 億元［6］。目前來(lái)看，刺梨果渣的利用度較低，以刺梨提取物制造藥品，可以大大提高刺梨的利用度，實(shí)現(xiàn)刺梨產(chǎn)品常態(tài)化［7］。

五環(huán)三萜類化合物是以6 個(gè)異戊二烯構(gòu)成的萜類化合物，在自然界中分布廣泛［8］。刺梨中含有大量的五環(huán)三萜酸，如齊墩果酸、熊果酸、薔薇酸［9，10］等。它們均具有多種重要的生物活性，如抗炎［11］、抗腫瘤［12，13］、保肝護(hù)肝［14-16］、治療胃潰瘍［17］等。

目前從刺梨中提取黃酮、三萜類化合物常用方法為超聲提取、微波輔助提取、水浴提取等［18-20］。查閱文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)有通過(guò)堿提酸沉法從刺梨中提取五環(huán)三萜類化合物的方法，也沒(méi)有關(guān)于用響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨中薔薇酸提取工藝的研究報(bào)道。堿提酸沉法相對(duì)于傳統(tǒng)提取方法節(jié)約成本、對(duì)環(huán)境友好。本研究以薔薇酸得率為目標(biāo)值，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝，旨在為薔薇酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。（表1）。提取液經(jīng)抽濾、減壓濃縮，用80%乙醇溶解，溶液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后按“1.3.2”方法測(cè)定后計(jì)算薔薇酸得率。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮刺梨購(gòu)自貴州省六盤水市刺梨種植基地，經(jīng)西南科技大學(xué)袁小紅教授鑒定為薔薇屬植物刺梨。

1.2 儀器與試劑

榨汁機(jī)，九陽(yáng)電器有限公司；電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUChI 公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；高效液相色譜儀，Agilent Technol?ogies Inc.。

薔薇酸標(biāo)準(zhǔn)品，滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+0.5%磷酸水溶液（80∶20）；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 薔薇酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取1 mg 薔薇酸標(biāo)準(zhǔn)品，用1 mL 甲醇超聲溶解于離心管中，稀釋配制質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品10 μL 注入色譜儀，在“1.3.1”的色譜條件下測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=9 629.4x-7.539 5，R2=0.999 8，線性范圍0～1.0 mg/mL。薔薇酸得率計(jì)算公式如下。

式中，m1為刺梨果渣粉末的質(zhì)量，g；m2為薔薇酸的質(zhì)量，g。

1.3.3 提取工藝研究

1）單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取0.6 g 刺梨果渣粉末于20 mL 試管內(nèi)，加入一定比例、一定pH 的堿液，設(shè)置水浴鍋溫度進(jìn)行提?。ㄒ陨显囼?yàn)均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)）

2）響應(yīng)面試驗(yàn)。使用Design Export 8.0 軟件中的Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件（表2），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察提取溫度、堿液pH、液固比3 個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值得率的影響。1.3.4 純化工藝研究

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1）酸沉pH單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取5份刺梨果渣粉末于試管中，每份0.6 g，加入12 mL 堿液調(diào)pH 至12，水浴鍋70 ℃提取120 min，提取2 次，過(guò)濾收集濾液，用酸沉將濾液pH 調(diào)到5、4、3、2、1。減壓濃縮后用相同體積80%無(wú)水乙醇溶解，微孔濾膜過(guò)濾后按“1.3.2”方法測(cè)定并計(jì)算薔薇酸質(zhì)量（設(shè)置3次重復(fù)）。

2）乙酸乙酯萃取次數(shù)單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取3份刺梨果渣粉末，每份0.6 g，在單因素最優(yōu)條件下提取。提取液抽濾，HCl 水溶液調(diào)pH 至2，用1 倍體積乙酸乙酯分別萃取1、2、3 次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮后稱重（設(shè)置3 次重復(fù)）。

3）乙酸乙酯萃取比例單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取3份刺梨果渣粉末，每份0.6 g，在單因素最優(yōu)條件下提取。提取液抽濾，HCl 水溶液調(diào)pH 至2，用0.5、1.0、1.5、2.0 倍體積乙酸乙酯分別萃取2 次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮后稱重（設(shè)置3 次重復(fù)）。

4）薔薇酸純化得率。純化后薔薇酸純化得率計(jì)算公式如下。

式中，m3為薔薇酸質(zhì)量，g；m4為乙酸乙酯萃取質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

從單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖1 至圖5）可知，當(dāng)液固比為15∶1（mL∶g）、提取時(shí)間120 min、提取溫度70 ℃、堿液pH 為12、提取2 次（綜合環(huán)保及得率考慮）時(shí)提取液中薔薇酸得率最高。

圖1 堿液pH 對(duì)薔薇酸得率的影響

圖2 液固比對(duì)薔薇酸得率的影響

圖3 提取溫度對(duì)薔薇酸得率的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)薔薇酸得率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)薔薇酸得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得出多項(xiàng)式回歸方程如下：Y=0.26+0.017A+0.035B+0.008 938C+0.006 050AB+0.008 025 AC+0.004 3BC-0.043A2-0.051B2-0.015C2，式 中Y 為薔薇酸得率，A、B、C 分別為提取溫度、堿液pH 和液固比。

響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)此模型進(jìn)行方差分析（表4），模型F 值是94.91，且P<0.01，表明建立的模型極顯著；失擬項(xiàng)P>0.05，回歸方程可代替實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，模型的決定系數(shù)R2=0.991 9，表明模型擬合度良好，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)薔薇酸得率，信噪比28.597>4，表明回歸方程可信度較高，該模型可用于理論預(yù)測(cè)優(yōu)化刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝。

模型的線性系數(shù)（A、B、C）、二次項(xiàng)系數(shù)（A2、B2、C2）和交互項(xiàng)（AC）的P<0.05，表明對(duì)薔薇酸得率有顯著影響。3 個(gè)因素對(duì)薔薇酸得率的影響大小次序?yàn)閴A液pH>提取溫度>液固比。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)值與各因素的等高線圖、三維空間響應(yīng)面圖可直觀地展現(xiàn)各因素之間的交互作用對(duì)薔薇酸得率的影響，通過(guò)等高線的密集程度判斷兩因素交互的影響程度［21］。由圖6a可知，等高線沿堿液pH 密集，堿液pH 對(duì)薔薇酸得率的影響大于提取溫度的影響。由圖6b 可知，堿液pH 固定不變時(shí)，提高提取溫度，薔薇酸得率先增大后減??；提取溫度固定不變，堿液pH 增加，薔薇酸得率先增加后逐漸減小；由圖7a 可知，等高線沿提取溫度密集，提取溫度對(duì)薔薇酸得率的影響大于液固比；由圖7b 可知，提取溫度保持不變，增加液固比，薔薇酸得率基本保持不變，液固比保持不變，增加提取溫度，薔薇酸的得率先增大后減??；由圖8a 可知，等高線沿堿液pH 密集，堿液pH 對(duì)薔薇酸得率的影響大于液固比；由圖8b 可知，堿液pH 保持不變，增加液固比，薔薇酸得率基本保持不變，液固比保持不變，增加堿液pH，薔薇酸得率先增大后減小。綜上3個(gè)因素對(duì)薔薇酸得率影響為堿液pH>提取溫度>液固比。

表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

圖6 堿液pH 和提取溫度交互作用對(duì)薔薇酸得率的影響

表4 回歸模型方差分析

圖8 液固比和堿液pH 交互作用對(duì)薔薇酸得率的影響

2.2.3 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證 通過(guò)Design expert 8.0 軟件中Numerical 優(yōu)化模塊得到預(yù)測(cè)值，給出模型預(yù)測(cè)最佳提取條件為堿液pH 12.37、提取溫度72.55 ℃、液固比17.07（mL∶g），提取時(shí)間120 min，提取2 次；在此優(yōu)化條件下薔薇酸得率為0.266%。因試驗(yàn)儀器精度限制，采用堿液pH 12，提取溫度73 ℃，液固比17（mL∶g），提取時(shí)間120 min，提取2次的提取條件進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得薔薇酸的平均得率為0.257%，RSD 為1.403%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異。

2.3 純化工藝研究

2.3.1 酸沉pH 的選擇 由高效液相色譜峰面積計(jì)算可得，酸沉pH 為5、4、3、2、1 時(shí)薔薇酸質(zhì)量分別為（0.349±0.024）、（0.965±0.036）、（1.125±0.038）、（1.329±0.03）、（1.373±0.003）mg。pH 為2 和1 時(shí)薔薇酸質(zhì)量相差不大，選用pH 為2 的酸沉條件。

2.3.2 乙酸乙酯萃取次數(shù)的選擇 用乙酸乙酯萃取的方法可以去掉大極性、水溶性雜質(zhì)。 經(jīng)計(jì)算后可得，乙酸乙酯萃取1、2、3 次的樣品乙酸乙酯層減壓濃縮后質(zhì)量分別為（0.031 2±0.000 5）、（0.038 8±0.000 2）、（0.039 3±0.000 6）g。考慮節(jié)能環(huán)保的因素，選萃取2 次。

2.3.3 乙酸乙酯萃取比例的選擇 結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取液體積比例為0.5、1.0、1.5、2.0 倍時(shí)樣品乙酸乙酯層減壓濃縮后質(zhì)量分別為（0.035 9±0.000 8）、（0.038 3±0.000 6）、（0.038 8±0.000 4）、（0.039 0±0.000 7）g?？紤]節(jié)能環(huán)保的因素，選萃取體積比例為1.0 倍體積。

3 結(jié)論

以薔薇酸得率為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了提取刺梨果渣粉末中薔薇酸的工藝條件，最佳試驗(yàn)條件為堿液pH 12、提取溫度73 ℃、液固比17︰1（mL︰g），提取時(shí)間120 min，提取2 次；經(jīng)酸沉pH 2、乙酸乙酯1.0 倍體積萃取2 次后薔薇酸的純化得率可達(dá)3.77%。區(qū)別于傳統(tǒng)的提取方法，采用堿提酸沉的提取方法，提取工藝簡(jiǎn)便易行、成本低、幾乎零污染，且使用刺梨果渣作為提取對(duì)象，大大提高了刺梨的利用度，可為工業(yè)化提取分離薔薇酸提供參考依據(jù)。