何際嬋 董志超

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571737)

桑葉為?？疲∕oraceae）植物桑（Morus alba L.）的葉，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目的功效［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，桑葉中含有多種羥基生物堿，其中以1-脫氧野尻霉素（DNJ）為代表的多羥基生物堿是桑葉中重要的降血糖成分［2-3］。DNJ 是從桑樹(shù)中發(fā)現(xiàn)的一種天然哌啶生物堿，它可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制小腸粘膜上的ɑ-糖苷酶的活性，減緩葡萄糖的吸收速率，降低餐后血糖濃度，從而發(fā)揮治療糖尿病的作用［4-5］。但桑葉的DNJ 含量受桑樹(shù)品種、生長(zhǎng)環(huán)境、桑葉部位等影響較大［6］。任立松等［7］為探明東北地區(qū)不同桑樹(shù)品種間1-脫氧野尻霉素含量的差異，對(duì)10 個(gè)現(xiàn)行品種葉片中的DNJ含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明不同品種間DNJ 含量存在一定的差異。禚蘇等［8］安康地區(qū)具有代表性的24 個(gè)桑樹(shù)栽培品種桑葉為原材料，運(yùn)用反相高效液相色潽法測(cè)定各品種春季桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量，結(jié)果表明，安康地區(qū)桑樹(shù)品種中桑葉DNJ 含量具有顯著差異。

近幾年，在“東桑西移”“北桑南移”的結(jié)構(gòu)性區(qū)域調(diào)整下，海南的蠶桑產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展［9］，并建立了桑樹(shù)種質(zhì)資源圃。

但目前尚未見(jiàn)有關(guān)海南種植桑葉品種DNJ含量測(cè)定的報(bào)道。DNJ 因其結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)色團(tuán)，所以很難采用HPLC 法直接測(cè)定。目前，桑葉中DNJ 的檢測(cè)多采用HPLC-ELSD法［10］、HPLC-FLU法［11］、HPLCMS法［12］和柱前衍生化HPLC-UV法［13］等。本研究運(yùn)用柱前衍生化HPLC-UV 法對(duì)海南省目前種植的31個(gè)桑樹(shù)品種桑葉進(jìn)行DNJ含量測(cè)定，為桑葉在海南的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

供試材料為海南創(chuàng)科農(nóng)旅集團(tuán)桑樹(shù)種質(zhì)資源圃中栽植的海南省主要桑種品種，包括粵桑11號(hào)、黑珍珠、日本甜桑、胖果桑、強(qiáng)桑2號(hào)、大十、紅果2 號(hào)、紅果5 號(hào)、抗青283、桂桑優(yōu)62、桂桑6號(hào)、農(nóng)桑14號(hào)、新西蘭垂桑、新西蘭九曲龍桑等，共31 個(gè)品種。于2020 年6 月，取桑枝頂自下7、8 片葉，于50℃烘干至恒重，將以上樣品粉碎后過(guò)60目篩，備用。

1.1.2 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（G1329A 自動(dòng)控溫進(jìn)樣器，G1311A 四元泵，G1316A 柱溫箱；美國(guó)安捷倫公司）；電子天平（BSA224S—CW；賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ－700DA 型；江蘇昆山）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisfer）；GZX－9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.1.3 試劑

1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，10027491），美國(guó)麥克林公司；9-氯甲酸芴甲酯（FMOC-CL，純度＞98%，C10074878），美國(guó)麥克林公司；乙腈（色譜純，178508），德國(guó)默克公司；氯化鉀、硼酸、氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；水為雙重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

參考鄭曉靜等［14］的方法，并略有改動(dòng)。色譜柱：Waters C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1% 醋酸（35∶65，V/V）；流速：1.00 mL/min；柱溫： 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 對(duì)照品與供試品溶液的制備

精密稱取DNJ 對(duì)照品10 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，搖勻，得1.0 mg/mL對(duì)照品溶液，置冰箱備用。

精密稱取供試桑葉粉0.5 g 于15 mL 離心管中，加入6 mL 50%乙醇水溶液，超聲提取30 min（溫度50℃，功率200 W）；以5 000 r/min 離心30 min，收集上清液，重復(fù)提取3次，合并3次提取液。

1.2.3 DNJ的衍生化

桑葉供試品溶液及DNJ對(duì)照品溶液的衍生化反應(yīng)參照文獻(xiàn)［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，依照上述色譜條件測(cè)定。以峰面積作為縱坐標(biāo)，以濃度作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：y=47 820.489x+247.586 82 （r=0.994 9，n=5）。結(jié)果表明，DNJ 在0.308～12.622 μg 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算峰面積得RSD=1.08%。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份桑葉的供試品溶液，分別在第1、3、5、8、10、12 h 進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)定峰面積，計(jì)算得RSD=0.89%（n=6），結(jié)果顯示，該溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

依照供試品溶液制備方法平行制備5 份強(qiáng)桑2號(hào)桑葉供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得RSD=1.45%（n=5），結(jié)果顯示，該方法具有較好的重現(xiàn)性。

圖1 1-脫氧野尻霉素對(duì)照品（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取6份已知含量的強(qiáng)桑2號(hào)粉末各0.1 g，分別加入DNJ 對(duì)照品溶液，按“1.2.2”方法制備溶液，再按上述色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果得平均回收率為99.5%，RSD=1.90%（n=6），表明本測(cè)試方法符合加樣回收率的要求，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DNJ的加樣回收率

2.6 方法檢測(cè)限及定量限的確定

方法檢測(cè)限、定量限是通過(guò)所測(cè)得色譜峰的信噪比（S/N）來(lái)確定。S/N=3 對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為該方法的檢測(cè)限；S/N=10對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為該方法的定量限。通過(guò)柱前衍生化HPLC-UV法測(cè)定不斷稀釋的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到該方法的檢測(cè)限和定量限分別為0.23、0.65 μg/mL。

2.7 樣品測(cè)定

按“1.2.2”方法制備3 份樣品，再分別進(jìn)行樣品測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。海南栽培的31個(gè)桑樹(shù)品種中，有3 個(gè)桑樹(shù)品種的DNJ 含量在3.00 mg/g 以上，即強(qiáng)桑2 號(hào)、大十、大白珍珠；其中DNJ 含量最高的是強(qiáng)桑2 號(hào)，為3.68 mg/g，其次為大十、大白珍珠，分別為3.23、3.15 mg/g；有7 個(gè)桑樹(shù)品種的DNJ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在2.00～3.00 mg/g：抗青283、桂桑優(yōu)62、日本甜桑、胖果桑、強(qiáng)桑3 號(hào)、油桑和陜860；有19個(gè)桑樹(shù)品種的DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在1.00～2.00 mg/g。而黑珍珠桑、桂芒桑、紅果5 號(hào)等桑葉品種DNJ含量較低，分別為0.62、0.88、0.96 mg/g。

3 討論

結(jié)果表明，不同品種DNJ 含量的變化較大，DNJ 含量3.68～0.62 mg/g，其中強(qiáng)桑2 號(hào)中DNJ 含量最高，為3.68 mg/g；黑珍珠桑DNJ 含量最低（0.62 mg/g）；強(qiáng)桑2號(hào)中DNJ含量是黑珍珠桑的5.93倍。說(shuō)明不同桑樹(shù)品種產(chǎn)生的DNJ 有差異，為選育高DNJ 含量的桑樹(shù)品種奠定基礎(chǔ)。強(qiáng)桑2 號(hào)不但DNJ 含量最高，且葉片肥大，可以作為DNJ類的藥食產(chǎn)品開(kāi)發(fā)原材料。

鄭曉靜等［14］用RP-HPLC 方法對(duì)桑葉中的DNJ 含量進(jìn)行了測(cè)定，該方法最大的特點(diǎn)是沒(méi)有加入甘氨酸和0.1%的醋酸終止DNJ 的衍生化反應(yīng)。從本實(shí)驗(yàn)借鑒該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及回收率的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，只要在12 h 內(nèi)完成檢測(cè)，即表明該方法穩(wěn)定可靠且更簡(jiǎn)便。

表2 不同品種桑葉中DNJ的含量

本實(shí)驗(yàn)考查了酸水、去離子水、稀醇3種溶劑對(duì)DNJ 提取率的影響，結(jié)果表明稀醇提取的DNJ 含量最高，最終選擇稀醇作為提取溶劑。

有文獻(xiàn)報(bào)道稱，DNJ 的日服用有效劑量至少為6 mg，才能起到預(yù)防或治療糖尿病的目的，而桑葉中DNJ 的含量偏低，如何有效提高桑葉中DNJ 的含量將是未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)桑葉研究的方向之一。