武珊珊 丁其歡 周雪芳 馬占霞 楊雪梅 邵宛芳 蘇建美

(1 滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院 云南省普洱市 665000;2 云南省綠色食品發(fā)展中心 云南省昆明市 650000)

酶工程是于1971 年第一屆國際酶工程會議上首次命名的一項技術(shù)，即將酶學(xué)基本原理與化學(xué)工程技術(shù)及基因工程有機(jī)結(jié)合形成的新型應(yīng)用技術(shù)，是基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程以外的現(xiàn)代五大生物工程技術(shù)之一，主要研究酶的生產(chǎn)純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾與改造等，在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。酶是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜且精巧的生物催化劑，具有催化效率高、專一性強的特點，其功能受到各種物理化學(xué)因子的影響和調(diào)控［1］。

茶作為一種天然飲品，茶樹生長發(fā)育、茶葉加工制造、茶葉深加工、茶葉檢測等都與酶的作用密不可分。隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，通過改變酶活性調(diào)控茶樹代謝、制茶品質(zhì)提升、茶葉深加工應(yīng)用等方面的研究日益增多。茶鮮葉中的酶類很復(fù)雜，常見的為氧化還原酶類和水解酶類，如多酚氧化酶、過氧化物酶、醇脫氫酶、脂肪氧合酶、葉綠素酶、單寧酶、糖苷酶、纖維素酶、果膠酶等，在茶樹代謝、茶葉深加工等方面，對于初級及次級代謝產(chǎn)物的變化、茶葉品質(zhì)的形成等有重要的調(diào)節(jié)作用［2］。

1 茶葉中酶的獲取

天然酶可通過從動植物細(xì)胞中直接提取、微生物發(fā)酵生產(chǎn)、化學(xué)合成等方式獲取。李榮林等［3］從茶樹鮮葉中提取了多酚氧化酶，并開展了酶的包埋交聯(lián)固定化研究。李立祥等［4］試驗通過采用浸提法、不同緩沖溶液勻漿法、丙酮粉法等不同方法，從茶鮮葉中提取了多酚氧化酶，并比較了不同酶提取方法對酶活力的影響?？卓『赖龋?］開展了從凍存茶鮮葉中提取多酚氧化酶的實驗，并研究了酶動力學(xué)特性。速曉娟［6］從茶鮮葉中提取了粗酶液，并添加應(yīng)用于黃茶加工過程中，結(jié)果顯示出較好的酶促黃變作用效果。張冬蓮［7］等應(yīng)用宏蛋白組學(xué)技術(shù)，從普洱茶熟茶發(fā)酵階段樣品中提取了微生物胞外酶，并依此建立了適用的提取方法。

2 酶在茶葉初加工中的應(yīng)用

以茶鮮葉為原料，在不同的工藝條件下，內(nèi)含物質(zhì)在酶的作用下發(fā)生理化變化的過程，即為茶葉初加工，又稱為茶葉初制過程。隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，外源酶近年來多用于添加在各類茶葉的初加工過程中，如纖維素酶、蛋白酶、單寧酶等單一酶或組合酶，在改善夏茶品質(zhì)，優(yōu)化茶葉原有的香氣與滋味，提升茶葉品質(zhì)方面得到了廣泛應(yīng)用。

2.1 酶在茶鮮葉處理的應(yīng)用

袁林穎等［8］研究證實，可通過對茶鮮葉進(jìn)行超高壓加工技術(shù)處理，降低多酚氧化酶活性，有助于后續(xù)綠茶制作品質(zhì)的提升。Takeo等［9］首次提出，茶鮮葉中的葡萄糖苷酶可水解糖苷物質(zhì)，釋放出芳樟醇、香葉醇等香氣物質(zhì)，對于成茶香氣的形成有重要的作用。范仕勝等［10］研究發(fā)現(xiàn)，茶鮮葉經(jīng)人工光源處理后，β-葡萄糖苷酶與多酚氧化酶活性均提高，可促進(jìn)品質(zhì)成分的變化及香氣的提高。金心怡等［11］通過遠(yuǎn)紅外與日光兩種不同萎凋方式的對比試驗，證實遠(yuǎn)紅外萎凋葉的各酶活性強于日光萎凋葉。

2.2 外源酶在綠茶初加工中的應(yīng)用

汪珈慧等［12］以殼聚糖作為載體，戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化纖維素酶，對夏季綠茶進(jìn)行酶解，研究出最佳綠茶制作工藝。馮云［13］通過在綠茶夏茶加工過程中添加木瓜蛋白酶、單寧酶、纖維素酶后，分別提高了茶湯的鮮爽度、降低了苦澀度、增加了甜度，總體提升了綠茶夏茶的品質(zhì)。夏進(jìn)偉等［14］研究通過在云南大葉種下叉烘青的揉捻過程中，噴施木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶，結(jié)果顯示夏茶品質(zhì)得到明顯提高。

2.3 外源酶在紅茶初加工的應(yīng)用

羅晶晶等［15-16］通過在萎凋過程中添加外源纖維素酶、木聚糖酶及木瓜蛋白酶，探討了不同外源酶對夏季金觀音紅茶及英紅九號紅茶內(nèi)含成分的影響。曾曉雄［17］試驗表明，在紅碎茶加工中添加蛋白酶，可使香氣變好、湯色變亮、滋味增強。譚振初等［18］在紅碎茶加工過程中，添加了從茶幼果提取的多酚氧化酶，發(fā)現(xiàn)茶黃素含量明顯提高，紅碎茶品質(zhì)顯著提升。

2.4 外源酶在青茶初加工的應(yīng)用

肖世青［19］發(fā)現(xiàn)，可在鐵觀音夏茶初制的搖青工藝后或初烘工藝前添加蛋白酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、漆酶或復(fù)合酶等外源酶，證實漆酶與β-葡萄糖苷酶可改善夏茶鐵觀音的香氣與滋味。張雪波［20］試驗發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度和比例的漆酶與α-半乳糖苷酶處理可明顯改善安溪鐵觀音暑茶品質(zhì)。肖安風(fēng)［21］利用固態(tài)發(fā)酵的單寧酶二次加工低檔鐵觀音干茶，顯著提升了原有品質(zhì)。

2.5 外源酶在黑茶初加工的應(yīng)用

趙熙等［22］通過在黑毛茶渥堆過程中添加纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶的試驗，可使黑毛茶的多酚類、可溶性糖、水浸出物等物質(zhì)含量提高，使黑毛茶的滋味趨于醇厚。聶樅寧［23］證實，在黑毛茶渥堆過程中添加土豆外源酶，可縮短加工時長，并提高四川黑茶的風(fēng)味品質(zhì)。張芬等［24］通過在六堡茶的渥堆過程中添加纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和過氧化物酶，研究了外源酶對六堡茶主要物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律的影響。趙冰等［25］用蘋果、梨、香蕉外源多酚氧化酶對普洱茶進(jìn)行酶促處理后，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)茶葉內(nèi)部化學(xué)成分的氧化聚合，茶褐素含量明顯增加，而茶多酚、兒茶素、水浸出物與茶黃素的成分的變化與酶活力存在極顯著的負(fù)相關(guān)性。雷林超等［26］在曬青毛茶發(fā)酵過程中，通過添加阿魏酸酯酶與木聚糖酶，并以高效液相法測定的內(nèi)含物質(zhì)含量的變化為指標(biāo)，證實酶處理有利于增加普洱茶的附加值。楊富亞等［27］在普洱茶渥堆過程中聯(lián)合應(yīng)用多酚氧化酶、多糖水解酶類、單寧酶、蛋白酶等制成的復(fù)合酶制劑，可一定程度上增加水浸出物、茶多酚、可溶性糖的含量，簡化渥堆工藝，使普洱茶品質(zhì)得到綜合提升。

2.6 外源酶在白茶初加工的應(yīng)用

邱麗玲［28］在不同季節(jié)的福鼎白茶鮮葉原料中添加酶制劑組合的研究認(rèn)為，得出酶處理可明顯改善白茶品質(zhì)的結(jié)論。張艷梅等［29］在特異茶樹品種紫娟白茶初制萎凋過程中添加脂肪酶，并加以輕微包揉、發(fā)酵，結(jié)果顯示促進(jìn)了白茶品質(zhì)的提升。

2.7 外源酶在黃茶初加工的應(yīng)用

速曉娟［6］將茶鮮葉酶添加在黃茶的殺青及揉捻過程中的試驗，顯示酶液有效促進(jìn)了酶促黃變，改善了原有悶黃技術(shù)的進(jìn)程。

3 酶在茶葉深加工的應(yīng)用

茶葉深加工指以茶鮮葉、成品茶、副茶等為原料，采用相應(yīng)的物理、化學(xué)和生物技術(shù)生產(chǎn)出含茶或茶有效成分的新產(chǎn)品的加工過程。茶葉深加工也是有效解決中低檔茶出路、提升茶葉附加值、拓展茶葉應(yīng)用領(lǐng)域、延伸茶葉產(chǎn)業(yè)鏈的重要途徑。

3.1 酶在速溶茶、茶膏加工的應(yīng)用

速溶茶生產(chǎn)中，可通過添加單寧酶、蛋白酶、果膠酶等酶水解酯型兒茶素去除部分茶多酚，而降低苦澀度、減少茶乳酪形成，增強速溶茶的冷溶性與澄清度。Philip 等［30］通過將細(xì)碎的鮮茶葉進(jìn)行單寧酶處理，獲得了速溶茶。鐘艷梅等［31］以低檔綠茶為原料，對其水提液添加外源過氧化氫酶進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，酶促轉(zhuǎn)化成紅茶茶湯，為研究優(yōu)質(zhì)速溶紅茶提供了依據(jù)。尚楠［32］通過采用蛋白酶、纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶處理安吉白茶片茶湯，制作出高氨基酸速溶白茶。方可等［33-34］通過將β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶添加在速溶綠茶粉烏龍茶粉水溶液的試驗，證實β-葡萄糖苷酶可顯著改變2 種速溶茶粉水溶液的香氣，且α-L-鼠李糖苷酶與β-葡萄糖苷酶對增強速溶綠茶粉水溶液的青草香具有協(xié)同增效作用。潘斐［35］研究發(fā)現(xiàn)，以氨基酸、茶多糖、茶多酚含量變化為指標(biāo)，當(dāng)添加的植物水解酶濃度為0.6%時，普洱茶膏感官品質(zhì)最優(yōu)。

3.2 酶在茶飲料加工的應(yīng)用

酶技術(shù)在茶葉浸提、過濾與澄清、轉(zhuǎn)溶等茶飲料生產(chǎn)工藝中得到廣泛應(yīng)用。Takino 等［36］最早應(yīng)用單寧酶，以減少茶湯中茶乳酪的形成，最終達(dá)到茶飲料澄清的效果。饒建平［37］實驗以綠茶（龍井）為原料，采用殼聚糖為載體固定化單寧酶來澄清茶湯。許勇泉等［38］通過添加單寧酶水解酯型兒茶素的試驗，研究探討單寧酶處理對綠茶茶湯的沉淀復(fù)溶和回收利用的影響。鄭寶東等［39］利用蛋白酶-果膠酶復(fù)合酶處理茶湯后，結(jié)果顯示茶湯滋味及膜過濾通量均優(yōu)于單獨酶處理。鐘艷梅等［40］利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶對紅茶茶湯進(jìn)行沉淀澄清試驗，研究表明這2種酶處理均能顯著提高茶湯透光率，起到澄清作用。蘇二正等［41］應(yīng)用單寧酶與β-葡萄糖苷酶的共固定化酶技術(shù)處理后，茶飲料的除混與增香方面顯示出良好的效果。多試驗結(jié)果表明，果膠酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶作用于烏龍茶、綠茶、紅茶等茶湯后，芳樟醇、香葉醇等香氣成分增加，茶湯香氣得到顯著提升［42-44］。李平等［45］將黑曲霉中提取的β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于果汁、茶汁、果酒等飲品，顯示出較好的增香效果。郭昊蔚［46］實驗證實，綠茶茶湯經(jīng)果膠酶和纖維素酶處理后，茶飲料色澤及滋味均得到改善。

3.3 酶在茶葉天然產(chǎn)物提取與合成的應(yīng)用

茶葉中含有茶多酚、茶色素、茶多糖、茶皂素等多種具有生物活性的天然產(chǎn)物，近些年來，學(xué)者對其生理學(xué)功能進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但茶葉天然產(chǎn)物含量較低、較難直接提取，酶工程技術(shù)作為新型生物工程技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于茶葉天然產(chǎn)物的提取與合成領(lǐng)域。

3.3.1 酶在茶葉天然產(chǎn)物提取的應(yīng)用

楊文雄［47］以紅茶為研究對象，采用酶技術(shù)和超微粉碎技術(shù)對紅茶的靜態(tài)、動態(tài)萃取和萃取動力學(xué)過程進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并比較了不同方式萃取紅茶后的茶湯品質(zhì)的優(yōu)劣，探討了紅茶萃取的因素。劉菁等［48］利用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶單一酶或其復(fù)合酶處理茶樹老葉后，茶多酚、茶多糖、氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)含量得到顯著提高。楊劉艷等［49］以粒徑為0.63 mm 的茶葉為原料，研究復(fù)合酶輔助提取法，結(jié)果表明復(fù)合酶（纖維素酶和果膠酶）對有效成分的提取效果較好，且條件溫和、操作簡便。譚淑宜等［50］試驗證實經(jīng)0.3%的纖維素酶或0.8%的蛋白水解酶處理后綠茶和紅碎茶水浸出物提取率可提高20%。Chandini 等［51］在茶葉提取試驗過程中添加果膠酶，發(fā)現(xiàn)水浸出物含量相對增加了11.5%。

鄭生宏等［52］采用纖維素酶+果膠酶的復(fù)合酶法研究了輔助浸提綠茶多酚的最佳工藝。謝藍(lán)華等［53］以單樅茶為實驗材料，研究了復(fù)合酶解輔助乙醇提取茶多酚的工藝條件。王巖巖等［54］采用纖維素酶處理綠茶茶湯，試驗結(jié)果顯示茶多酚提取率上升14.17%。程琦等［55］以殼聚糖為載體對單寧酶進(jìn)行固定化，研究了酯型兒茶素的水解反應(yīng)。王佛生等［56］應(yīng)用馬鈴薯作為多酚氧化酶（PPO）的酶源進(jìn)行了酯型茶黃素酶促氧化的制備研究。

張婷婷等［57］通過在武夷巖茶粗老茶葉制作中添加木瓜蛋白酶和纖維素酶輔助浸提的試驗，確定高含量游離氨基酸水提液的最佳浸提工藝參數(shù)。靳偉剛等［58］在茶葉蛋白提取試驗中采用新的復(fù)合酶酶法提取工藝，使蛋白提取率和蛋白純度都有了較大的提高。譚曉妍等［59］以茶渣為原料，研究優(yōu)化了堿性電解水耦合酶提取茶渣蛋白的工藝。

金友蘭等［60］以綠茶水提茶渣為原料，試驗結(jié)果證實，輻照預(yù)處理輔助纖維素酶水解綠茶水提茶渣的工藝有利于水溶性糖的制備。高仁金等［61］采用超聲波輔助纖維素酶提取茶葉廢料中的茶多糖，并以含量作為指標(biāo)，通過正交實驗優(yōu)化茶多糖的提取工藝。陳文娟等［62］利用蝸牛酶輔助提取白芽奇蘭茶多糖，并對酶解提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

王曉琴［63］采用纖維素酶開展茶葉籽油水酶法提取茶皂素工藝研究，茶皂素提取率高達(dá)6.8%。游瑞云等［64］采用淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和蛋白酶對茶皂素進(jìn)行純化水解的工藝研究。王婭玲等［65］利用超聲輔助纖維素酶法進(jìn)行了茶粕中茶皂苷的提取工藝研究。劉潔等［66］以夏秋季都勻毛尖為原料，利用纖維素酶和果膠酶輔助提取低檔毛尖茶中總黃酮。楊宇華等［67］以沖泡后的武夷巖茶茶渣為原料，以α-淀粉酶粗制、木瓜蛋白酶精制獲取了膳食纖維，并確定了最佳提取條件。Zheng等［68］以“交聯(lián)-包埋-交聯(lián)”固定化酶技術(shù)將β-葡萄糖苷酶固定于海藻酸鹽，研究表明綠茶、烏龍茶和紅茶中的芳香性物質(zhì)成分總量得到顯著提高，固定化β-葡萄糖苷酶可實現(xiàn)連續(xù)提取后回收。

3.3.2 酶在茶葉天然產(chǎn)物合成的應(yīng)用

兒茶素作為茶葉中茶多酚的主體成分，被證實其生理活性較強，但因其溶解性、穩(wěn)定性等問題導(dǎo)致在體內(nèi)生物利用度不高，研究顯示通過酶法對其分子進(jìn)行?；?、糖苷化等化學(xué)修飾得到的兒茶素產(chǎn)物可最大化保持兒茶素的生物活性［69-70］。薛金金等［71］利用豐水梨等植物源多酚氧化酶進(jìn)行了氧化兒茶素合成茶黃素和聚酯型兒茶素的研究。吳光亮等［72］利用皇冠梨多酚氧化酶催化表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯合成茶黃素雙沒食子酸酯。丁兆堂等［73］通過納米碳酸鈣固定化酶，進(jìn)行了體外制備茶黃素。王斌等［74］研究了填充床反應(yīng)器上固定化漆酶連續(xù)氧化茶多酚制備茶黃素，自制了連續(xù)化制備茶黃素的填充床生物反應(yīng)器，為茶黃素的制備提供一種可行的連續(xù)化方法。王揮［75］以黑曲霉菌株為產(chǎn)單寧酶的出發(fā)菌株，采用紫外和氮離子注入方式對其進(jìn)行誘變選育，與固定化酶進(jìn)行制備沒食子酸及其丙酯的研究。從茶葉中提取分離L-茶氨酸通常涉及耗時、高成本和操作復(fù)雜等因素，隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，L-谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、L-谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶幾種生物酶的工業(yè)合成解決了以上問題［76］。

4 酶在茶葉檢測方面的應(yīng)用

Chindilous［77］通過制作茶葉中酚類物質(zhì)定量的酶膜傳感器，并與光導(dǎo)纖維連用的柱形酶傳感器，用于茶葉黃烷醇類的定量檢測。崛江秀樹等［78］通過在氧電極頂部透氧性聚匹氟乙烯膜表面用丙烯樹脂網(wǎng)固定L-氨基酸氧化酶制成的酶傳感器，用于測定茶葉中的氨基酸含量。生物酶技術(shù)還廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測，主要包括微生物降解技術(shù)、酶抑制技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及酶免疫放大技術(shù)［79］。許娟等［80］利用硝酸纖維素膜固定植物酯酶，建立了NC 膜固定化植物酯酶快速檢測農(nóng)藥殘留的方法。李莉梅等［81］采用對乙酰膽堿酯酶抑制率法對市售綠茶中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行了測定的研究。劉淑娟等［82］在金電極表面電沉積二氧化鋯納米粒子以固定乙酰膽堿酯酶（AChE），制成AChE/ZrO2 粒子層/金電極（AChE/ZrO2/Au）電流型有機(jī)磷生物傳感器，研究了茶葉中的對氧磷有機(jī)磷農(nóng)殘的快速檢測。傅秀華等［83］試驗證實酶解技術(shù)還可用于降解茶葉中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，同時對茶葉品質(zhì)無明顯影響。

5 酶在茶葉其他方面應(yīng)用

酶在茶葉的貯藏保鮮技術(shù)，主要利用酶的專一性和高效性以及安全無污染的特性，快速、徹底地清除茶葉貯藏體系中存在的氧氣，阻斷茶葉劣變反應(yīng)，以達(dá)到保鮮茶葉的目的。張玲等［84］應(yīng)用葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖混合在一起，包裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內(nèi)，使茶葉保鮮。黃彤［85］研究了不同種類外源酶對茶湯貯存過程中品質(zhì)的影響，結(jié)果表明添加單寧酶及葡萄糖氧化酶對茶湯的護(hù)色及防沉淀效果最好。

孫珂等［86］利用變色栓菌茶渣固態(tài)發(fā)酵制備的茶渣固態(tài)漆酶對雙偶氮類染料進(jìn)行脫色，并研究了脫色機(jī)制和脫色效果。黃茂坤等［87］以鐵觀音茶梗為原料，采用纖維素酶水解法進(jìn)行改性處理研究，為茶梗綜合利用提供了理論依據(jù)。

6 酶工程技術(shù)在茶葉方面應(yīng)用的思考與展望

本文綜述就今年來國內(nèi)外各項酶工程技術(shù)在茶葉方面的應(yīng)用，即在茶葉中天然酶的獲取，外源酶添加于各類茶葉的初加工過程中以提升原有工藝的茶葉品質(zhì)；外源酶添加在速溶茶、茶膏、茶飲料的制作過程中以提高飲料的澄清度、提升香氣及改善滋味；應(yīng)用于茶葉天然產(chǎn)物提取，以提高提取率及優(yōu)化提取工藝；應(yīng)用于茶葉天然產(chǎn)物合成及制備，以最大程度地保持生物活性等；應(yīng)用于茶葉檢測方面，以實現(xiàn)檢測的定量、快速、便捷性；應(yīng)用于茶葉貯藏保鮮及廢料綜合利用，為更多應(yīng)用提供依據(jù)。

酶工程技術(shù)作為五代現(xiàn)代生物工程技術(shù)之一，因酶本身具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、反應(yīng)效率高等特點，在茶葉領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。目前在茶葉方面的應(yīng)用主要有茶葉中各類酶的提取分離，固定化酶技術(shù)等在茶葉天然產(chǎn)物的提取與合成，外源酶在各類茶初精制中提升茶葉香氣、滋味的應(yīng)用，外源酶在茶飲料、速溶茶、茶膏改善澄清度、提高提取率、保色等茶葉深加工方面的應(yīng)用，生物酶傳感器等在茶葉檢測方面的應(yīng)用等。但與此同時，酶活性的制約因素也很多，如酶促反應(yīng)的溫度、酸堿條件、輔基、酶蛋白構(gòu)象、載體性質(zhì)等，故從茶葉中提取分離酶的成本較高，外源酶活力較難保持等。因此，如何應(yīng)用最新的酶工程技術(shù)，使酶的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為應(yīng)用成果，真正在茶葉大規(guī)模生產(chǎn)中使用、實現(xiàn)茶天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)、快速在線茶葉檢測，是值得不斷探究的。