羅燕羽 黃紹力 劉紹欽 劉偉光 魏利國 秦鵬

(廣州市農(nóng)業(yè)科學研究院 廣東廣州 510308)

香蕉（Musaspp.）為芭蕉科芭蕉屬植物，是我國華南地區(qū)四大佳果之一，也是世界著名的熱帶、亞熱帶水果。在一些發(fā)展中國家與地區(qū)，香蕉還作為當?shù)剞r(nóng)民的主要糧食，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織認定為僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大重要糧食作物［1］。由于傳統(tǒng)的香蕉組織培養(yǎng)需要一個無菌的環(huán)境，要求接種過程、培養(yǎng)過程在無菌的環(huán)境中進行，使得人工、設施設備、培養(yǎng)基和供電成本等大大增加，而且香蕉屬于一種低值的農(nóng)產(chǎn)品，其投入成本高，大大限制了組織培養(yǎng)技術(shù)在香蕉產(chǎn)業(yè)中的推廣應用［2］。尤其是近幾年，隨著物價、電力、人力成本的不斷上漲，生產(chǎn)成本已越來越高，嚴重制約了香蕉組培苗產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴大和質(zhì)量提升，對香蕉優(yōu)質(zhì)種苗的培育也造成了嚴重的影響。因此，進行香蕉開放式組培的研究具有重要的意義。

開放式組織培養(yǎng)是指在抑菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)操作脫離嚴格無菌環(huán)境，在自然、開放的有菌環(huán)境中進行植物的組織培養(yǎng)［3］，由于其既不需要高溫高壓滅菌，又不要求無菌操作，從而可以降低香蕉組織培養(yǎng)的生產(chǎn)成本和對高溫高壓滅菌鍋等特種設備的要求，投入成本可以大幅度降低，是近年來發(fā)展逐漸成熟的一種低成本的開放式組織培養(yǎng)技術(shù)［4］，目前已成功應用于魔芋、甘蔗、紅豆杉和構(gòu)樹等［5-15］植物中。

植物開放式組培的關(guān)鍵在于培養(yǎng)基中添加的抑菌劑［16-17］。。目前市場上應用于植物開放式組培的抑菌劑種類很多，不過不同的植物在組培過程中所產(chǎn)生的污染菌類不同，其適合的抑菌劑種類和濃度存在差異［18］。雖然關(guān)于香蕉開放式組培的研究已有報道［2］，但僅限于對含氯消毒劑的研究，并未對其他種類的抑菌劑進行篩選研究。本研究以巴西蕉為試驗材料，通過在組培增殖和生根階段的培養(yǎng)基中加入不同種類和濃度的抑菌劑，研究其抑菌效果和對香蕉組培苗增殖與生根生長的影響，以期篩選出適合于香蕉開放式組培的最佳抑菌劑種類和濃度，為今后香蕉開放式組織培養(yǎng)的進一步研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香蕉為巴西蕉，采自廣州市農(nóng)業(yè)科學研究院花都基地。供試的6種抑菌劑均為市售品，分別為次氯酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司）、植培靈（上海宇涵生物科技有限公司）、益培?。ㄉ虾Ｓ詈锟萍加邢薰荆⑶寰祝ㄉ钲谑兄锌魄板\有限公司）、S106 殺菌劑（江西萬年創(chuàng)新植物組培應用技術(shù)研究所）、80%代森錳鋅可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

將嫩芽清除表面泥土后于陰涼通風處晾干，環(huán)剝?nèi)~鞘并切去部分假莖，留取5 cm×5 cm×8 cm的莖尖。超凈臺中用75%酒精浸泡10 min，無菌水沖洗5 次后進行切割，留取2 cm×2 cm×3 cm 的莖尖，再用0.1%的升汞溶液消毒8 min，期間不斷振蕩，用無菌水清洗5～6 次后切割，留取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的莖尖，接入不定芽誘導培養(yǎng)基：MS+5.00 mg/L 6-BA +0.02 mg/L NAA +5.00 mg/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+6 g/L 卡拉膠，于28℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照強度為2 000 lx，光照時間為10 h/d。

將誘導出的不定芽，經(jīng)病毒檢測后不帶病毒的不定芽繼代3 次，繼代培養(yǎng)基為：MS+3.00 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂，光照強度為2 000 lx，光照時間為10 h/d，溫度控制在28℃左右，每代培養(yǎng)25 d。

1.2.2 培養(yǎng)基的配置

香蕉開放式組培的增殖與生根培養(yǎng)基采用傳統(tǒng)香蕉組培的培養(yǎng)基配方，將定容煮沸后的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0之后，添加入（V/V）0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 的 次 氯 酸 鈉，0.10%、0.25%、0.35%、0.45%的植培靈，0.03%、0.05%、0.10%、0.20% 的 益 培 隆，0.03、0.06、0.12、0.18 g/L的清菌易，0.01%、0.03%、0.05%、0.07%的S106 殺菌劑，0.01、0.04、0.07、0.10 g/L 的代森錳鋅。增殖與生根共48 個處理，每個處理分裝10 瓶，重復3 次。抑菌劑添加完成后，攪拌均勻定量分裝至干凈并晾干水分的組培瓶中，放置7 d 后使用。對照培養(yǎng)基采用傳統(tǒng)的高溫高壓滅菌方式，滅菌后放置7 d再使用。

1.2.3 開放式培養(yǎng)接種

選擇干凈、整潔的房間作為接種室，接種前用紫外燈照射0.5 h。接種器具的消毒和接種操作與傳統(tǒng)香蕉組培接種方式相同。增殖芽每瓶接種6個芽叢，每叢2～3 個芽，共24 個處理，每個處理接種10 瓶，重復3 次；生根苗每瓶接種10 株，共24 個處理，每個處理接種10 瓶，重復3 次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

污染率、增殖系數(shù)、褐變率和生根率用Mis‐crosoft Excel 2016進行統(tǒng)計分析，用SPSS17.0進行差異顯著性分析。

污染率=污染瓶數(shù)/該處理接種瓶數(shù)×100%

增殖系數(shù)=增殖后總芽數(shù)/該處理接種總芽數(shù)

褐變率=褐變芽數(shù)/該處理接種總芽數(shù)×100%

生根率=生根植株數(shù)/該處理接種總植株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 次氯酸鈉在香蕉開放組培中的應用效果

次氯酸鈉是一種常用的消毒劑。在香蕉的開放式組培中0.01%的濃度就具有良好的抑菌效果，此時的增殖系數(shù)為1.79，生根率為89.31%，根數(shù)也較多，但同對照相比，在增殖系數(shù)和生根率上存在較大差異（表1、圖1）。當次氯酸鈉濃度為0.02%時，組培苗基部褐變較嚴重，其增殖與生根的生長受到抑制，隨著次氯酸鈉濃度的提高，抑制效果越明顯，當次氯酸鈉濃度達到0.04%時，增殖苗與生根苗皆出現(xiàn)了死亡的情況。可見，采用次氯酸鈉為香蕉開放組培的抑菌劑時，其濃度不應超過0.01%，否則其增殖與生根生長皆會受到影響。

2.2 植培靈在香蕉開放組培中的應用效果

植培靈是植物開放組培專用的一種植物源抑菌劑。在試驗濃度處理下，0.10%濃度的植培靈能保證香蕉組培苗在開放式培養(yǎng)中不受細菌污染，真菌污染率為6.67%；0.35%和0.45%的植培靈雖然抗菌效果好，但會影響香蕉組培苗的生長；0.45%濃度植培靈處理的香蕉組培苗褐變情況的情況較嚴重，增殖生長也明顯受抑制，生根率只有72.37%；效果最佳的濃度為0.25%，雖然香蕉組培苗的基部有輕微褐變的情況，但并不影響其生長，且沒有污染的情況出現(xiàn)（表1、圖1）。

表1 不同種類和濃度的抑菌劑在香蕉開放組培中的應用效果

圖1 不同抑菌劑種類和濃度對香蕉增殖芽生長影響

2.3 益培隆在香蕉開放組培中的應用效果

益培隆作為一種植物開放組培專用抑菌劑，與微生物接觸后，可使細胞死亡，從而迅速殺滅或抑制其生長。本試驗結(jié)果表明（表1、圖1），在香蕉的開放式組培中其抑菌效果差，對香蕉組培苗具有嚴重的毒害作用。在濃度為0.03%時，污染率高達93.67%，且香蕉組培苗嚴重褐變、生長受阻；當濃度為0.05%時，接種7 d 香蕉組培苗就開始出現(xiàn)死亡的情況；濃度為0.20%時，接種7 d 香蕉組培苗就已全部死亡?？梢?，益培隆不適合于香蕉的開放式組培。

2.4 清菌易在香蕉開放組培中的應用效果

清菌易隨著濃度的提高，其抑菌效果越明顯，但只對真菌有效，對細菌抑制效果差。0.03 g/L濃度的清菌易接種7 d 就出現(xiàn)污染的情況，且此時香蕉增殖芽只生長不增殖，生根苗尚未開始生根就已全部污染死亡了；當清菌易濃度為0.06 g/L 和0.12 g/L 時，其污染率分別為76.33%和53.33%，此時的增殖苗也只生長不增殖，生根苗未污染的植株可以生根，但生根數(shù)較少；當抑菌劑濃度達到0.18 g/L 時，還有40.71%的污染率，且植株出現(xiàn)褐變的情況，增殖芽只生長不增殖，未污染的生根苗基本都可以生根，只是生根數(shù)較少（表1、圖1）。

2.5 S106殺菌劑在香蕉開放組培中的應用效果

隨著S106 殺菌劑濃度的升高，抑菌效果越明顯（表1、圖1）。0.05%的濃度可完全抑制污染的發(fā)生，只是植株褐化較嚴重，芽的增殖生長與伸長生長也受到抑制；0.07%的濃度時，褐變和生長受抑制情況越明顯；0.01%和0.03%的濃度雖然增殖與生根生長正常，但增殖芽偏白，且細菌污染率過高，分別為66.67%和28.52%。可見，低濃度的S106 殺菌劑抑菌效果差，高濃度時毒害作用明顯，不適于香蕉的開放式組培。

2.6 代森錳鋅在香蕉開放組培中的應用效果

代森錳鋅是一種安全的廣譜性抑菌劑，隨著濃度的升高，其抑菌效果越明顯，但總體的抑菌效果較差。濃度為0.01 g/L 時，在培養(yǎng)基制作完成7 d 內(nèi)就已全部出現(xiàn)細菌污染；0.04 g/L 的濃度在接種一周后也全部出現(xiàn)了細菌污染；0.07 g/L的濃度，雖然起到了一定的抑菌效果，香蕉組培苗的生長也正常，可污染率過高，為34.36%；抑菌效果最好的濃度為0.10 g/L，但細菌污染率依然高于10%，且此時增殖芽偏白，不利于香蕉芽的增殖生長，不過生根生長正常，生根率為100%，且生根數(shù)較多（表1、圖1）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

試驗表明，抑菌劑濃度越高，抑菌效果越好，不過當濃度達到一定限度后會影響香蕉組培苗的生長，這與王趙玉等［19］的觀點一致，因此，在選擇抑菌劑的時候要綜合考慮抑菌效果和抑菌劑對香蕉組培苗生長的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，有些抑菌劑完全不適于香蕉的開放式組培，不僅污染率高，且嚴重影響了香蕉組培苗的生長，比如益培隆、清菌易、S106 殺菌劑和代森錳鋅。益培隆在濃度為0.03 g/L 時，香蕉組培苗就出現(xiàn)嚴重的褐化和生長受抑制的現(xiàn)象，當濃度進一步提高時甚至出現(xiàn)了死亡的情況，這可能是由于益培隆中含有某種成分對香蕉組培苗具有毒害作用，使其出現(xiàn)褐化甚至死亡的情況；清菌易在0.03 g/L 時，雖然增殖生長完全受到抑制，但生根生長卻不受影響，可能是清菌易中含有抑制6-BA 活性的物質(zhì)，使6-BA 無法進入細胞中發(fā)揮作用或降解失活了，導致香蕉組培苗的增殖生長受到抑制。S106 殺菌劑在低濃度時，不僅抑菌效果差，且增殖芽出現(xiàn)偏白的情況，隨著濃度的升高雖然抑菌效果越明顯，當濃度為0.05%時，雖然沒有出現(xiàn)污染的情況，但此時組培苗褐化情況嚴重，生長嚴重受到抑制。因此，S106 殺菌劑也不適合香蕉的開放式組培。代森錳鋅作為一種安全的廣譜抑菌劑，低濃度時抑菌效果差，在培養(yǎng)基配置好7 d 內(nèi)就已經(jīng)全部細菌污染了，可能在該濃度范圍內(nèi)只對真菌有效，細菌則達不到抑菌效果。當濃度為0.10 g/L 時，雖然抑菌效果較好，但出現(xiàn)了增殖芽偏白的情況，這可能與代森錳鋅中所含的Mn 元素有關(guān)，雖然Mn 有助于植物的光合作用，但Mn 含量過高反而會使凈光合速率下降，影響植株的生長發(fā)育［20］，所以0.10 g/L 的濃度使增殖芽出現(xiàn)偏白的情況。

次氯酸鈉作為一種常用消毒劑，有氧化和氯化作用，多用于水的凈化，主要消毒原理是通過氧化細菌蛋白質(zhì)，破壞細胞壁及自身代謝并死亡。目前已經(jīng)有關(guān)于次氯酸鈉在香蕉開放中應用的報道［21］，研究結(jié)果基本與本試驗一致，0.01%的次氯酸鈉在香蕉開放組培中抑菌效果良好，但在增殖系數(shù)上存在較大的差異，這可能與接種手法、培養(yǎng)基配方等存在差異有關(guān)。

供試的幾種殺菌劑中，植培靈在0.25%的濃度就可很好的抑制污染的發(fā)生，且此時的增殖系數(shù)和生根率最高，增殖系數(shù)為2.22，生根率為93.33%，與對照的差距最小。0.10%的植培靈次之，雖然細菌污染率為6.67%，不過該污染率在5.0%左右，且沒有真菌污染，從植物組培工廠化生產(chǎn)的角度考慮在可接受范圍內(nèi)?？梢姡参镌搭惖囊志鷦┰谥参镩_放式組培中具有較大的優(yōu)勢，不僅抑菌效果良好，且對組培苗生長的影響最小。

3.2 結(jié)論

在香蕉組培的增殖和生根階段中，抑菌劑濃度越高，抑菌效果越好，但益培隆、清菌易、S106 殺菌劑和代森錳鋅完全不適合于香蕉的開放式組培，在低濃度時不僅抑菌效果差，且組培苗褐化、生長受抑制現(xiàn)象明顯，高濃度時甚至會導致香蕉組培苗出現(xiàn)死亡的情況。次氯酸鈉和植培靈的抑菌效果好，在低濃度時即可抑制污染的發(fā)生，但次氯酸鈉對香蕉組培苗增殖和生根生長的效果不如植培靈。綜合抑菌效果和對香蕉組培苗生長的影響，植培靈更適合于香蕉的開放式組培，0.25%的濃度較佳，0.10%的濃度次之。