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        PD 小鼠模型應(yīng)用硫辛酸對(duì)自噬蛋白表達(dá)水平的影響

        2021-04-10 10:12:34魏濤范小娟2
        人人健康 2021年6期
        關(guān)鍵詞:爬桿硫辛酸免疫組化

        魏濤 范小娟2

        (1 徐州醫(yī)科大學(xué)公共實(shí)驗(yàn)研究中心 221000 2 江蘇省軍區(qū)徐州第三離職干部休養(yǎng)所門診部 221000)

        帕金森(PD)為中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,可累及神經(jīng)、精神、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷,誘發(fā)腦部病變,嚴(yán)重危害患者身體健康[1]。目前,臨床上尚未明確PD 發(fā)病機(jī)理,但可能與線粒體功能異常、自噬作用、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等有關(guān)[2]。國(guó)內(nèi)外諸多研究證實(shí)[3-4],線粒體自噬在保持神經(jīng)元活性、神經(jīng)細(xì)胞功能完整性方面具有重要作用。為進(jìn)一步了解硫辛酸對(duì)PD 小鼠自噬蛋白表達(dá)水平的影響,現(xiàn)對(duì)80 只健康7 周齡雄性小鼠展開研討,具體如下。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        儀器與材料:LSM710 型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司公司),58404R 型高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)。

        免疫組化檢測(cè)試驗(yàn)盒、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒、PINK1 抗體、DJ-1 單克隆抗體、Parkin 單克隆抗體、MPTP 分別來自于上海莼試生物技術(shù)有限公司、北京市艾德萊生物科技有限公司、巴傲得生物科技有限公司、上海康朗生物科技有限公司、艾美捷科技有限公司、四川宇康生物技術(shù)有限公司、珠海市泛海生物技術(shù)有限公司、上海仁捷生物科技有限公司。

        實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:80 只健康7 周齡雄性小鼠(徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)。

        1.2 方法

        (1)分組方法:以抓鬮法把80 只小鼠均分成四組,即PD模型組、預(yù)保護(hù)組、研究組、正常對(duì)照組。

        (2)模型制作:以MPTP 背部皮下注射方式,制備PD 小鼠模型。用背部皮下注射給藥方式予以研究組、預(yù)保護(hù)組、PD模型組MPTP25mg/kg,每周2 次,連續(xù)治療5 周。造模前,用以上同樣給藥方式給予預(yù)保護(hù)組a-硫辛酸60mg/kg;造模后,予以研究組a-硫辛酸60mg/kg,持續(xù)注射2 周。正常組不給予任何處理。

        (3)行為學(xué)評(píng)分:在MPTP 用藥后,查看小鼠活動(dòng)狀況。藥物注射3min 內(nèi),小鼠便出現(xiàn)全身抽搐、鼠尾與毛豎起、易激怒、抓鼻、步態(tài)蹣跚等反應(yīng),10~20min 后恢復(fù)至正常,即可判定模型制作成功。

        (4)懸掛實(shí)驗(yàn):用金屬絲把小鼠掛到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,高度控制為30cm,統(tǒng)計(jì)從懸掛到落地時(shí)間,并進(jìn)行評(píng)分,其中,0~4s 即為0 分,5~9 分即為1 分,10~14s 即為2 分,15~19s 即為3 分,20~24s 即為4 分,25~29s 即為5 分,≥30s 即為6 分。

        (5)爬桿實(shí)驗(yàn):自制爬桿,將小鼠頭向上放于頂部,統(tǒng)計(jì)小鼠從一開始運(yùn)動(dòng)到徹底轉(zhuǎn)變?yōu)轭^朝下運(yùn)動(dòng)時(shí)間與抵達(dá)桿底的時(shí)間和。測(cè)試前,先訓(xùn)練小鼠爬桿約5 次,再次測(cè)量5次,取其平均值,每次測(cè)試間隔時(shí)間控制為1min。

        (6)以Western blotting 法測(cè)定DJ-1、Parkin、PINK1、TH:在行為學(xué)判斷后開展檢測(cè)。利用0.1mg/g10%水合氯醛實(shí)施腹腔注射,以完成深度麻醉;行斷頭操作,然后,于冰上實(shí)施開顱取腦,徹底洗凈殘余血液,把黑質(zhì)紋狀體分離,并剪碎組織,將其與組織分解液充分混合,4℃下,離心,取上清液放于-80℃下保存?zhèn)溆?。蛋白定量后,分裝,保證蛋白濃度相同;待添加等體積上樣緩沖液后,沸煮5min。之后,添加一抗,在4℃條件下孵育1 夜;洗膜后,將二抗加入,孵育(37℃)2h,再次洗膜。利用ECL 進(jìn)行顯色,將顯影曝光,以Iamage lab 軟件對(duì)各蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析。

        以免疫組化法測(cè)定小鼠DJ-1、Parkin、紋狀體PINK1、黑質(zhì)TH:待開展行為學(xué)評(píng)定后,采用10%水合氯醛實(shí)施麻醉,將心臟暴露,將靜脈留針穿入左心室,打開右心房,將生理鹽水注入左心房,用多聚甲醛進(jìn)行灌注,斷頭取腦后,固定。梯度脫水,石蠟包埋,實(shí)施連續(xù)切片。選取小鼠紋狀體、黑質(zhì)不重疊的4 倍視野4 個(gè),在顯微鏡作用下觀測(cè)組織微觀結(jié)構(gòu)變化狀況,統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核表現(xiàn)為紫藍(lán)色或淺藍(lán)色,細(xì)胞漿表現(xiàn)為棕黃色。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS24.0 處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料( )以F檢驗(yàn),P<0.05,即差異顯著。

        2結(jié)果

        2.1 4 組小鼠懸掛時(shí)間與爬桿時(shí)間對(duì)比

        PD 模型組、預(yù)保護(hù)組、研究組懸掛時(shí)間均短于正常對(duì)照組,爬桿時(shí)間均長(zhǎng)于正常對(duì)照組(P<0.05)。PD 模型組懸掛時(shí)間均短于預(yù)保護(hù)組、研究組,爬桿時(shí)間均長(zhǎng)于以上兩組(P<0.05),見表1。

        表1 4 組小組懸掛時(shí)間、爬桿時(shí)間對(duì)比(,s)

        表1 4 組小組懸掛時(shí)間、爬桿時(shí)間對(duì)比(,s)

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        2.2 4 組Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

        較正常對(duì)照組,其他三組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平下降(P<0.05)。PD 模型組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平均低于預(yù)保護(hù)組、研究組(P<0.05),見表2。

        2.3 4 組免疫組化法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

        相比于正常對(duì)照組,其他三組DJ-1、Parkin、PINK1 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)較少(P<0.05)。PD 模型組DJ-1、Parkin、PINK1 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)均少于預(yù)保護(hù)組、研究組(P<0.05),見表3。

        3 討論

        近年來,跟隨著神經(jīng)元變性的深入研究,發(fā)現(xiàn)PD 治療藥物組間失去效價(jià)與有效性,故而,臨床上需改變治療方案。限制藥物應(yīng)用的重要原因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)障礙等不良反應(yīng)。硫辛酸屬生物膜成分,在動(dòng)植物體內(nèi)均可見。二硫代脂肪酸為硫辛酸還原形式,其可預(yù)防及避免氧化應(yīng)激。二硫代脂肪酸與硫辛酸屬于天然抗氧化劑,為脫氧酶輔助因子,均可整合腦中金屬離子,增加維生素C、E 含量,減輕腦組織損傷,減少膜電位損傷量,提高相關(guān)酶活性,故而,就線粒體營(yíng)養(yǎng)物而言,硫辛酸能起到靶向作用。在PD 常規(guī)藥物治療中,硫辛酸能有效減輕因抗PD 所引起的不良作用,進(jìn)而提升患者運(yùn)動(dòng)功能與生活質(zhì)量。鑒于此,可將硫辛酸作為PD 的新型方式。

        表2 4 組Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比()

        表2 4 組Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比()

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        PINK1 常見于Parkin 上游,在機(jī)體線粒體功能受到損傷時(shí),其能促使Parkin 蛋白活化,誘導(dǎo)吞噬反應(yīng)。而Parkin 水平的下降,可造成線粒體斷裂,降低細(xì)胞對(duì)鈣離子的處理能力,增加對(duì)應(yīng)激易感性。除氧化作用之外,DJ-1 也可誘發(fā)自噬反應(yīng)。DJ-1 主要通過對(duì)Nurrl 的激活、上調(diào)多巴胺,改善TH 基因表達(dá)情況。DJ-1 缺失為造成自噬標(biāo)志物堆積與線粒體表型的主要原因。所以,DJ-1 蛋白功能障礙能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,從而誘發(fā)PD。研究中,四組懸掛時(shí)間、爬桿時(shí)間相比,存在明顯差異,其中,正常對(duì)照組懸掛時(shí)間最長(zhǎng),爬桿時(shí)間最短,PD 模型組懸掛時(shí)間最短,爬桿時(shí)間最長(zhǎng),這提示PD 模型制備成功,能有效保證后期實(shí)驗(yàn)開展的有效性。四組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平相比,正常對(duì)照組均最高,PD模型組均最低,這表示硫辛酸能改善PD 小鼠DJ-1、Parkin、PINK1、TH 表達(dá)水平。四組DJ-1、Parkin、PINK1 神經(jīng)元數(shù)相比,正常對(duì)照組均最高,PD 模型組均最少,這說明硫辛酸能對(duì)PD 小鼠神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。

        表3 4 組免疫組化法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比(,個(gè)/4 倍視野4 個(gè))

        表3 4 組免疫組化法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比(,個(gè)/4 倍視野4 個(gè))

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        綜上,硫辛酸對(duì)PD 小鼠自噬蛋白表達(dá)水平可起到一定調(diào)節(jié)作用,有助于其病情控制。

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