萬(wàn) 欣，王 磊*，李文斌，江 浩

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.江蘇揚(yáng)州城市森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，江蘇 揚(yáng)州 225000；3.揚(yáng)州市茱萸灣風(fēng)景區(qū)管理處，江蘇 揚(yáng)州 225000 )

隨著人們對(duì)城市森林生態(tài)環(huán)境的關(guān)注,對(duì)城市森林的生物多樣性研究工作日益重視。土壤中的微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和具有決定性影響的組分之一[1-2]。已有研究表明，森林土壤微生物群落作為分解者、共生體或病原體，在調(diào)節(jié)生物地球化學(xué)循環(huán)方面起到關(guān)鍵作用[3-4]。土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征是表征森林土壤環(huán)境質(zhì)量變化的最敏感、最有潛力的指標(biāo)，其種群、數(shù)量、分布及多樣性等群落結(jié)構(gòu)特征可直接或間接地影響森林土壤的基本理化性質(zhì)，進(jìn)而影響森林樹木的生長(zhǎng)發(fā)育[5-8]。因此，研究土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性在評(píng)價(jià)各種因素(包括自然因素和人為因素)干擾導(dǎo)致的森林土壤質(zhì)量變化方面起著重要的指示作用。

本研究選取揚(yáng)州市茱萸灣風(fēng)景區(qū)內(nèi)6種不同植被類型的城市森林作為研究對(duì)象，對(duì)不同植被類型下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性指數(shù)進(jìn)行比較研究，以期為該地區(qū)城市森林生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能的保護(hù)、合理利用土壤、營(yíng)造最佳生態(tài)效益的林分、防止地力衰退提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

本研究地點(diǎn)設(shè)在揚(yáng)州市廣陵區(qū)茱萸灣風(fēng)景區(qū)內(nèi)，是江蘇揚(yáng)州市城市生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站的主站點(diǎn)。該區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)性濕潤(rùn)氣候向溫帶季風(fēng)氣候的過(guò)渡區(qū)，平均海拔2 m，年均氣溫15.8 ℃，年均降水量864 mm。該區(qū)域的植被為地帶性次生林植被，林分生長(zhǎng)良好，在長(zhǎng)江下游平原水網(wǎng)地區(qū)具有典型性和代表性。經(jīng)實(shí)地調(diào)查取點(diǎn)，確定6個(gè)不同植被種類的城市森林樣地作為本研究的研究樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)各設(shè)置樣地1個(gè)。樣地的具體位置和概況見(jiàn)表1。

表1 樣地概況

1.2 土壤樣品采集和處理

在每個(gè)樣地內(nèi)的四角與中心選取5個(gè)采樣點(diǎn)，將表面的腐殖質(zhì)層移除后，用土鉆采集土壤深度0—20 cm的土層，挑出凋落物、細(xì)根和小石塊等雜物后充分混合，以減少異質(zhì)性帶來(lái)的影響。土壤樣品過(guò)2 mm尼龍篩放入自封袋密封，以備測(cè)定土壤細(xì)菌群落多樣性[9]。

1.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性測(cè)定[10]

稱取0.5 g新鮮土樣，按照美國(guó)強(qiáng)力土壤試劑盒的說(shuō)明書來(lái)提取土壤細(xì)菌DNA。設(shè)計(jì)16Sv3-v4區(qū)特定引物擴(kuò)增特異區(qū)域，得到420 bp左右擴(kuò)增片段。加接頭，采用Hiseq 2500平臺(tái)，測(cè)序得到2×300 bp的paired-end數(shù)據(jù)，通過(guò)拼接，可以得到較長(zhǎng)序列，從而進(jìn)行16 S分析[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(Dirty Data)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU的序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時(shí)，對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性計(jì)算、花瓣圖分析，以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息。然后使用SPSS17.0軟件采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析(0.05水平)[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測(cè)序結(jié)果

土壤樣品通過(guò)優(yōu)化過(guò)濾低質(zhì)量序列后得到有效序列總數(shù)為36 913條，土壤樣品序列經(jīng)拆分、去冗余后在97% 相似度下進(jìn)行OTUs聚類共得到1 946個(gè)OTUs。為了考察指定樣品間的基因數(shù)目分布情況，分析不同樣品之間的基因共有和特有信息，繪制了花瓣圖。由圖1所見(jiàn)，在97%的相似水平上統(tǒng)計(jì)得到樣地土壤細(xì)菌212個(gè)，約占OTU總數(shù)的10.89%，3號(hào)茱萸林獨(dú)有的土壤細(xì)菌的OTU數(shù)目最多有83個(gè)，約占總數(shù)的4.27%。由此可見(jiàn)，3號(hào)山茱萸林與其他森林群落土壤細(xì)菌的OTUs分布差異較大。

注：花瓣圖中每個(gè)花瓣代表一個(gè)樣地的樣本(分別用S1—S6表示)，不同的顏色代表不同的樣地的樣本，中間的core數(shù)字代表的是所有樣地的樣本中共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣地樣本特有的OTU數(shù)目。圖1 不同植被類型下土壤細(xì)菌OTU花瓣圖

2.2 土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

物種多樣性的分析包含樣品中的物種組成的豐富度和均勻度2個(gè)因素，通常用Observed Species指數(shù)、Chao指數(shù)，Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等指數(shù)來(lái)評(píng)估樣本的物種多樣性，指數(shù)越高，表明樣本的多樣性越復(fù)雜[14]。Observed Species指數(shù)和Chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，即群落中物種的數(shù)量。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性[15-16]。通過(guò)測(cè)序，6種植被類型森林土壤測(cè)序的幾種多樣性指數(shù)由表2所示。

表2 97%條件下各林型土樣多樣性指數(shù)

由表2可知，6個(gè)林型的土壤測(cè)序的Coverage指數(shù)均在0.995以上，說(shuō)明該試驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映供試土壤樣品的真實(shí)情況。6個(gè)林型土壤樣本中，Chao1指數(shù)和Observed Species指數(shù)以2號(hào)水杉林最高，說(shuō)明該林型的土壤細(xì)菌的物種總數(shù)、菌群豐度和復(fù)雜度最高，其次是1號(hào)竹林和3號(hào)茱萸林。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也是以2號(hào)水杉林最高，說(shuō)明該林型的土壤細(xì)菌群落的均勻度最高，其次是1號(hào)竹林和6號(hào)雜闊林。

2.3 土壤細(xì)菌相對(duì)豐度

在門分類水平上，相對(duì)豐度前20的物種聚類分析圖如圖2所示。其中，相對(duì)豐度平均值大于1%的優(yōu)勢(shì)菌門有11個(gè)，其相對(duì)豐度值見(jiàn)表3。

圖2 門分類水平Top20物種相對(duì)豐度聚類圖

表3 11種優(yōu)勢(shì)菌門在不同林分土壤中的相對(duì)豐度值 %

由表3可知，1號(hào)竹林(S1)、2號(hào)水杉林(S2)、4號(hào)雜闊林(S4)、6號(hào)雜闊林(S6)的土壤中變形菌(Proteobacteria)相對(duì)豐度最高，分別為38.15%,33.54%,44.25%,30.66%，其次是酸桿菌(Acidobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、厚壁菌(Firmicutes)；3號(hào)茱萸林(S3)和5號(hào)松柏林(S5)土壤中厚壁菌相對(duì)豐度最高，分別是42.09%和41.14%，其次是變形菌、酸桿菌、綠彎菌。

為了進(jìn)一步分析各林型土壤細(xì)菌群落多樣性差異，本研究基于Weighted Unifrac距離來(lái)進(jìn)行PCoA分析。圖3為PCoA對(duì)6種林型土壤樣本的土壤細(xì)菌群落多樣性的分析結(jié)果，如果2個(gè)樣本距離較近，則表示這2個(gè)樣本的物種組成較相近。

注：橫坐標(biāo)表示第1主坐標(biāo)，百分比則表示第一主坐標(biāo)對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)率；縱坐標(biāo)表示第2主坐標(biāo)，百分比表示第2主坐標(biāo)對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)率。圖中點(diǎn)分別表示各個(gè)樣本。S1-S6表示6種不同林型的樣本。 圖3 PCoA分析圖

由圖3可見(jiàn)，3號(hào)山茱萸林(S3)和1號(hào)竹林(S1)與其他林型的土壤樣本距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明這2種林型的物種組成與其他4種林型的土壤細(xì)菌的物種組成有明顯差異。其他4個(gè)林型的土壤樣本距離較近，說(shuō)明這4種林型的土壤細(xì)菌的物種組成無(wú)明顯差異。

3 結(jié)論與展望

由此可見(jiàn)，揚(yáng)州茱萸灣風(fēng)景區(qū)內(nèi)水杉林土壤細(xì)菌的物種總數(shù)、菌群豐度和復(fù)雜度最高，其次是竹林和茱萸林。水杉林的土壤細(xì)菌群落的均勻度最高，其次是竹林和雜闊林。山茱萸林獨(dú)有的土壤細(xì)菌的OTU數(shù)目最多，與其他森林群落土壤細(xì)菌的OTUs分布差異較大；在門分類水平上，該地區(qū)相對(duì)豐度平均值大于1%的優(yōu)勢(shì)菌門有11個(gè)。

為深入研究城市森林土壤微生物群落在生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程中的作用，希望在進(jìn)一步研究中針對(duì)土壤微生物多樣性、土壤理化指標(biāo)和大氣環(huán)境因子進(jìn)行同步監(jiān)測(cè)，研究大氣環(huán)境-土壤-微生物之間的相關(guān)性，對(duì)于預(yù)測(cè)城市森林對(duì)未來(lái)環(huán)境條件的響應(yīng)至關(guān)重要。