袁 莉 李素霞 王衛(wèi)華

菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校藥學(xué)與檢驗系，山東 菏澤 274000

肺癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中位居第一，2012年全球癌癥調(diào)查報告中顯示，中國新增肺癌患者307萬，其中死亡人數(shù)達(dá)到220萬人，占全球總發(fā)病率和死亡率的21.9%和26.8%，位居第一[1-3]。在我國最常見的肺癌類型為非小細(xì)胞肺癌，占肺癌總發(fā)生率的75%～85%[4-5]。NSCLC的發(fā)生和發(fā)展與多基因突變有關(guān)，而癌基因的激活和抑癌基因的缺失使細(xì)胞異常增殖，是腫瘤發(fā)生的主要原因。研究表明，PI3K/AKT通路的過度活化存在于多種腫瘤組織中[6-7]，EGFR作為該通路上游調(diào)節(jié)因子，可以激活PI3K，進(jìn)而促使AKT磷酸化。活化的AKT(P-AKT)是PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵，可以磷酸化下游多種蛋白分子，如BAD、mTOR等，由此發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡和促細(xì)胞增殖作用。TGF-α屬于表皮生長因子家族，可與細(xì)胞膜上的EGFR結(jié)合，促使其活化，引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)。PTEN是發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，可以使磷酸化磷脂酰肌醇D3位磷酸基發(fā)生脫磷酸作用，由此拮抗PI3K/AKT信號通路的活化。EGFR、P-AKT、和TGF-α在惡性腫瘤的信號傳導(dǎo)中關(guān)系密切，本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測以上蛋白表達(dá)，同時采用原位雜交方法檢測PTEN的基因表達(dá)，探討其與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系及各因子之間的相關(guān)性，為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和靶向治療藥物的選擇與研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選擇菏澤醫(yī)專附屬醫(yī)院2008年1月—2015年12月手術(shù)切除后經(jīng)兩位病理專家明確診斷為NSCLC的存檔石蠟標(biāo)本73例，男性60例，女性13例；年齡≤51歲18例，>51歲55例。參照WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，腺癌27例，鱗癌46例；高中分化50例，低分化23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無轉(zhuǎn)移33例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移28例，無轉(zhuǎn)移45例。選取10例同期手術(shù)切除的炎性假瘤并遠(yuǎn)離病灶2 cm的正常肺組織作為對照組。所有病例均未接受放化療。

1.2 試劑

鼠抗人EGFR單克隆抗體、PTEN原位雜交試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司，兔抗人P-AKT多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人TGF-α多克隆抗體購自上海晶天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化檢測 所有切片分別做HE染色和免疫組化染色(Maxvision二步法)，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，組織抗原經(jīng)高壓修復(fù)5 min，滴加Maxvision試劑，孵育、沖洗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染，封片。用已知陽性切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.2原位雜交檢測 操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，預(yù)雜交、雜交、恒溫箱38～42℃過夜，滴加封閉液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶等，DAB顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。

1.4 結(jié)果判斷

EGFR的著色部位位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，P-AKT的著色部位位于細(xì)胞漿，TGF-α、PTEN的著色部位均位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]并做適當(dāng)修改制定本研究的判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個癌細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞所占百分比。顯色癌細(xì)胞<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；再按照顯色癌細(xì)胞染色強(qiáng)度計分，無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。每例積分為顯色細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度的乘積，2分以下為陰性(-)，3分以上為陽性(+)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各因子按照不同臨床病理特征分組，每組間比較采用χ2檢驗，各因子之間的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)性分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN在NSCLC和正常肺組織中的表達(dá)

在NSCLC和正常肺組織中，EGFR的陽性率分別為68.5%(50/73)、30.0%(3/10)，P-AKT的陽性率分別為76.7%(56/73)、30.0%(3/10)，TGF-α的陽性率分別為72.6%(53/73)、20.0%(2/10)，三因子在NSCLC中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PTEN在NSCLC和正常肺組織中的陽性率分別為30.1%(22/73)、80.0%(8/10)，在正常肺組織中的表達(dá)顯著高于NSCLC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1～4)。

圖1 EGFR在中分化肺鱗癌中的表達(dá)(×400)

圖3 P-AKT在低分化肺腺癌中的表達(dá)(×400)

表1 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN與臨床病理特征的關(guān)系

在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及低分化組中，EGFR的陽性率分別為90.0%(36/40)、96.4%(27/28)、87.0%(20/23)，P-AKT的陽性率分別為87.5%(35/40)、92.9%(26/28)、95.7%(22/23)，TGF-α的陽性率分別為85.0%(34/40)、92.9%(26/28)、91.3%(21/23)，PTEN的陽性率分別為12.5%(5/40)、10.7%(3/28)、8.7%(2/23)，EGFR、P-AKT和TGF-α的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及高中分化組，而PTEN的表達(dá)卻明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及高中分化組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 NSCLC中EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN表達(dá)之間的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，PTEN基因和EGFR蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.454,P<0.001)，PTEN基因和P-AKT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.486,P<0.001)，PTEN基因和TGF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.668,P<0.001)，TGF-α和EGFR蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.311,P<0.001)，TGF-α和P-AKT蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.316,P<0.001)，P-AKT和EGFR蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.324,P=0.005)，各因子間的相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN表達(dá)之間的關(guān)系

3 討 論

本實驗結(jié)果顯示，EGFR在NSCLC中的蛋白表達(dá)顯著高于正常肺組織，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，提示EGFR不僅參與NSCLC的發(fā)生，還可能促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，可以作為評判NSCLC惡性程度的指示因子。多項研究均已證實EGFR作為PI3K/AKT信號通路的上游調(diào)節(jié)因子，其基因突變所致的蛋白過度表達(dá)，是該通路過度活化推動NSCLC發(fā)生發(fā)展的重要原因[10-12]。張萍等[13]的研究結(jié)果顯示，406例晚期肺腺癌患者中，EGFR基因突變?yōu)?05例，突變率達(dá)到了50.5%，其中19號外顯子缺失突變和21號外顯子L858R點突變最多見；Inoue等[14]報道中指出EGFR基因突變陽性是采用靶向藥物EGFR-TKI治療的重要預(yù)測指標(biāo)，由此說明EGFR不僅可以作為NSCLC惡性程度的指標(biāo)，也是基因靶向治療的重要靶點及預(yù)后指標(biāo)。

TGF-α作為表皮生長因子家族成員之一，可以與細(xì)胞膜上EGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使EGFR與其他EGFR和HER家族成員形成二聚體并發(fā)生磷酸化，活化的EGFR進(jìn)一步激活PI3K/AKT信號通路，參與多種癌細(xì)胞的生長歷程[15]，同時多研究發(fā)現(xiàn)TGF-α是引起腫瘤耐藥，降低臨床療效的原因之一[16-17]；研究顯示血清中TGF-α的表達(dá)水平可以預(yù)測多腫瘤化療后分子響應(yīng)的失敗率[18]；朱文良等[15]研究顯示，血清中TGF-α的表達(dá)水平可以預(yù)測NSCLC采用EGFR-TKI靶向治療的療效。在本研究中也顯示，TGF-α蛋白在NSCLC中表達(dá)高于正常肺組織，并且與EGFR呈正相關(guān)，共同推動NSCLC的發(fā)生發(fā)展，TGF-α不僅是EGFR的配體，也可以作為EGFR-TKI靶向治療后的預(yù)后指標(biāo)。

AKT是1977年Staal等[19]研究發(fā)現(xiàn)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱PKB。AKT雖是原癌基因，但未磷酸化的AKT是沒有活性的，研究表明，AKT作為PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵因子，可以被多因子激活[20]，PI3K與PIP3相互作用，促使AKT結(jié)構(gòu)中的催化結(jié)構(gòu)域Thr308和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域Ser473共同磷酸化，由此激活A(yù)KT(P-AKT)。多項研究顯示，EGFR基因突變和PTEN基因缺失通過級聯(lián)反應(yīng)可激活A(yù)KT，P-AKT繼續(xù)磷酸化下游蛋白分子，由此抑制細(xì)胞調(diào)亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[21-22]。本實驗結(jié)果顯示，P-AKT在NSCLC中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，并且與EGFR、TGF-α呈正相關(guān)，與PTEN呈負(fù)相關(guān)，說明P-AKT不僅參與NSCLC的發(fā)生，也提示EGFR、TGF-α的蛋白高表達(dá)及PTEN基因缺失促使AKT活化，催化NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移，與以上研究一致。

1997年，Steck等[23]研究人員發(fā)現(xiàn)染色體10q23等位基因缺失常伴有多種腫瘤的發(fā)生，后來研究人員在該位點發(fā)現(xiàn)一種抑癌基因，這種抑癌基因可以編碼具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性的蛋白質(zhì)，該抑癌基因即PTEN。PTEN具有雙特異性磷酸酶活性，當(dāng)其編碼的產(chǎn)物以磷脂為底物時，可促使PIP3脫磷酸，拮抗PI3K/AKT信號通路，防止細(xì)胞的失控性生長。多研究表明，PTEN基因的缺失促使PI3K/AKT通路過度活化，推動多系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生[24-26]。本實驗結(jié)果顯示，PTEN在NSCLC中的基因表達(dá)顯著低于正常肺組織，并且與P-AKT呈負(fù)相關(guān)，提示PTEN基因的缺失通過級聯(lián)反應(yīng)活化AKT，促進(jìn)NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移，另外，PTEN與EGFR、TGF-α也呈負(fù)相關(guān)，提示EGFR、TGF-α的高表達(dá)可能是引起PTEN基因缺失的原因之一。

綜上所述，EGFR、TGF-α和P-AKT的高表達(dá)以及PTEN基因缺失在NSCLC的生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，可以作為NSCLC檢測和預(yù)后的指標(biāo)以及靶向治療藥物的研究靶點。