劉亞東，盧小偉

作者單位：湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院骨外科，湖北 十堰442000

骨質(zhì)疏松癥是中老年人最常見的骨科疾病，隨著中國社會老齡化，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐步上升，而骨折是最常見也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（Diabetic osteoporosis，DOP）是糖尿病的并發(fā)癥之一，以糖尿病為特征，伴隨著骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)改變、骨強度降低和骨脆性增加。DOP是一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，2型糖尿病被認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥相關(guān)骨折的危險因素。目前，DOP的發(fā)病機制尚不清楚。既往研究表明，高糖環(huán)境下，成骨細(xì)胞的增殖受抑制，凋亡率明顯升高。黃芪總皂苷（Total saponins of Astragalus membranaceus，TSA）是黃芪主要的活性成分之一，現(xiàn)階段已分離得到包括黃芪皂苷Ⅰ-Ⅷ在內(nèi)的40多種三萜皂苷類成分。資料顯示，TSA可促進小腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞NSCs的增殖。由黃芪等藥材制成的黃芪散可以促進高糖作用下的成骨細(xì)胞增殖。黃芪注射劑可以明顯提高22例DOP病人的骨密度，取得較好療效。然而，TSA 作用于DOP的研究鮮見報道。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼RNA。報道指出，微小RNA-495-3p（miR-495-3p）通過調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生過程中的多種表觀遺傳修飾因子起到腫瘤抑制劑的作用，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）處理顯著下調(diào)人牙周膜細(xì)胞這miR-495-3p 表達，但miR-495-3p對成骨細(xì)胞的作用尚不明確。因此，2018年2月至2019年4月，本研究利用高糖誘導(dǎo)商購小鼠的細(xì)胞MC3T3-E1構(gòu)建DOP模型，觀察黃芪總皂苷對高糖培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并結(jié)合miR-495-3p探尋其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑

小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，黃芪總皂苷（純度≥98%）購自源葉生物公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，葡萄糖、噻唑藍（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulphoxide，DMSO）購自美國Sigma 公司，RIPA 裂解液購自美國Millipore 公司，miRNA 提取試劑盒購自上海Qiagen公司，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）購自上海生工生物工程公司，胰酶、凋亡試劑盒購自上海碧云天生物有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，β肌動蛋白（β-actin）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleave-caspase-3）抗體購自美國Cellular Signaling Technology 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

MC3T3-E1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2～3次，胰酶消化后進行接種傳代。轉(zhuǎn)染時，以1×10個/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板，待其生長至80%融合度時，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 試劑說明書進行，將miR-495-3p、抗miR-495-3p（anti-miR-495-3p）及各自陰性對照轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

細(xì)胞用隨機數(shù)表法隨機分為對照（NC）組（MC3T3-E1 細(xì)胞），高糖組（30 mmol/L 葡萄糖+MC3T3-E1細(xì)胞），高糖+不同濃度TSA 組（高糖+0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL TSA+MC3T3-E1 細(xì)胞），高糖+miRNA陰性對照（miR-con）組（高糖+轉(zhuǎn)染miR-con），高糖+miR-495-3p組（高糖+轉(zhuǎn)染miR-495-3p），高糖+TSA+抗miRNA陰性對照（anti-miR-con）組（高糖+2.0 μg/mL TSA+轉(zhuǎn)染anti-miR-con），高糖+TSA+anti-miR-495-3p（高糖+2.0 μg/mL TSA+轉(zhuǎn)染anti- miR-495-3p）。其中，TSA作用時間為48 h。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖

收集各組MC3T3-E1細(xì)胞，加入胰酶消化，以1×10個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，培養(yǎng)48 h，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 200 μL，37 ℃搖床孵育10 min，于酶標(biāo)儀測定細(xì)胞490 nm 波長處吸光度值（OD值），根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=實驗組OD/對照組OD×100%

1.4 細(xì)胞凋亡實驗

胰酶消化各組MC3T3-E1細(xì)胞，以5×10個/mL，加入500 μL Annexin V緩沖液重懸細(xì)胞，隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管，在室溫黑暗條件下用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 孵育30min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 qRT

-

PCR 檢測miR

-

495

-

3p 的表達水平

利用miRNA 提取試劑盒提取MC3T3-E1 細(xì)胞中總miRNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以制成的cDNA 為模板，U6 為參照，進行qRT-PCR 反應(yīng)。miR-495-3p 正向引物序列為5'-TCAATAAATTTGGTGGTCCTCGG-3'，反向引物序列為5'-TAGGCCTTGCACGAAGATGG-3'。反應(yīng)結(jié)束后，收集Ct值，以2法分析miR-495-3p相對表達量。

1.6 Western blotting 檢

測CyclinD1、Cleave

-

cas

pase

-

3蛋白表達

在各組細(xì)胞中加入RIPA裂解液，充分提取總蛋白，10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在5%脫脂奶粉中封閉1 h。加入一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST充分洗膜后與二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1h，加入TBST充分洗膜。置于化學(xué)發(fā)光液中顯色、顯影，以β-actin為參照，分析CyclinD1、Cleave-caspase-3相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TSA對成骨細(xì)胞MC3T3

-

E1（高糖）增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，與NC細(xì)胞組比較，高糖組MC3T3-E1細(xì)胞存活率大幅減少（

P

＜0.05）。與高糖細(xì)胞組比較，高糖與0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL 濃度TSA 組MC3T3-E1細(xì)胞存活率明顯升高，并呈劑量依賴性（

P

＜0.05）。后續(xù)實驗選擇2.0 μg/mL的TSA濃度進行相關(guān)研究。見表1。

表1 不同濃度TSA抑制成骨細(xì)胞MC3T3-E1（高糖）增殖/（%，±s）

2.2 TSA對成骨細(xì)胞MC3T3

-

E1（高糖）凋亡的影響及qRT

-

PCR檢測miR

-

495

-

3p的表達水平

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，相比于NC細(xì)胞組，高糖組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05）。相比于高糖細(xì)胞組，高糖與2.0 μg/mL TSA組明顯減少MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率（

P

＜0.05）。Western blotting檢測結(jié)果表明，與NC細(xì)胞組比較，高糖顯著增加MC3T3-E1細(xì)胞Cleavecaspase-3表達量（

P

＜0.05）。與高糖細(xì)胞組比較，高糖與2.0 μg/mL TSA組顯著降低MC3T3-E1細(xì)胞Cleavecaspase-3蛋白水平（

P

＜0.05）。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與NC細(xì)胞組相比，高糖組MC3T3-E1細(xì)胞中miR-495-3p 表達量大幅減少（

P

＜0.05）。與高糖細(xì)胞組相比，高糖與2.0 μg/mL TSA組明顯增加MC3T3-E1細(xì)胞中miR-495-3p表達量（

P

＜0.05）。見表2，圖1，。

表2 TSA對成骨細(xì)胞MC3T3-E1（高糖）凋亡的影響/±s

圖1 TSA對成骨細(xì)胞MC3T3-E1（高糖）凋亡的影響：A為Western blotting檢測Cleave-caspase-3蛋白表達；B為流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

2.3 miR

-

495

-

3p 促進成骨細(xì)胞MC3T3

-

E1（高糖）增殖，抑制凋亡

與NC 細(xì)胞組比較，高糖明顯降低MC3T3-E1 細(xì)胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表達量，提高細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05）。與高糖+miR-con 組比較，過表達miR-495-3p 明顯提高高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表達量，降低細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05）。見表3，圖2。

2.4 低表達miR

-

495

-

3p 可以逆轉(zhuǎn)TSA 對成骨細(xì)胞MC3T3

-

E1（高糖）增殖和凋亡的影響研究

高糖與2.0 μg/mL TSA 組明顯提高MC3T3-E1 細(xì)胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 水平，顯著降低細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3表達量（

P

＜0.05）。與高糖+TSA+anti-miR-con 組相比，高糖、2.0 μg/mL TSA 和轉(zhuǎn)染antimiR-495-3p組顯著降低MC3T3-E1細(xì)胞存活率、miR-495-3p 和CyclinD1 表達量，明顯提高細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平（

P

＜0.05）。見圖3，表4。

3 討論

本研究以高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷，這種模型構(gòu)建方式前人早有報道。吳娟等發(fā)現(xiàn)高糖高脂以時間依賴方式抑制成骨細(xì)胞增殖活性，促進細(xì)胞凋亡并上調(diào)cleaved caspase-3 表達。顏曉芳等指出間歇性高糖明顯降低成骨細(xì)胞中CyclinD1 及β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）水平。本研究中，高糖明顯減少MC3T3-E1 細(xì)胞存活率和CyclinD1 表達量，增加細(xì)胞凋亡率和Cleavecaspase-3表達（

P

＜0.05），這與上述研究一致。

表3 miR-495-3p促進成骨細(xì)胞MC3T3-E1（高糖）增殖，抑制凋亡/±s

表4 低表達miR-495-3p可以逆轉(zhuǎn)TSA對成骨細(xì)胞MC3T3-E1（高糖）增殖和凋亡的影響研究/±s

圖2 Western blotting檢測過表達miR-495-3p對高糖誘導(dǎo)CyclinD1和Cleave-caspase-3的影響

圖3 低表達miR-495-3p可以逆轉(zhuǎn)TSA對成骨細(xì)胞MC3T3-E1（高糖）增殖和凋亡的影響（Western blotting檢測）

黃芪總皂苷TSA 從藥用植物黃芪提取而來，是黃芪主要的活性成分，對各種類型的癌癥表現(xiàn)出抗腫瘤能力，還具有降血糖、抗炎、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等活性。黃芪可以改善血糖水平，在糖尿病及其并發(fā)癥治療中擁有廣泛的應(yīng)用前景。不同配比的黃芪總皂苷和姜黃素聯(lián)用對糖尿病模型大鼠具有良好的治療效果。以往的資料顯示，黃芪提取物或多糖對成骨細(xì)胞具有一定調(diào)節(jié)能力，可有效緩解大鼠卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。黃芪甲苷I刺激成骨細(xì)胞MC3T3-E1中β-連環(huán)蛋白和Runt家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達，通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路刺激成骨細(xì)胞分化。大鼠成骨細(xì)胞加入不同體積分?jǐn)?shù)的黃芪注射液分別培養(yǎng)3、5、7、9天，成骨細(xì)胞的增殖能力得到顯著促進，并呈現(xiàn)量效趨勢。黃芪甲苷IV 可作為促進骨整合的生長因子，激活Hedgehog信號通路并顯著促進人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖和遷移。然而TSA對高糖培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚未可知。本實驗中，TSA 明顯增加高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達量，降低MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平，提示黃芪總皂苷可以改善高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷，促進高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，與前人對黃芪及其皂苷促進成骨細(xì)胞增殖作用相符。

miRNA 是一種短鏈非編碼RNA，其通過引起靶mRNA 的降解或翻譯抑制來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達。已有證據(jù)表明，miRNA參與高糖刺激的成骨細(xì)胞分化過 程，例 如miR-335-5p，miR-424，miR-449。研究發(fā)現(xiàn)，miR-590-5p 過表達減弱高糖對MC3T3-E1生長的抑制作用，顯著促進成骨細(xì)胞生長和分化。然而，miR-495-3p是否會影響高糖條件下MC3T3-E1細(xì)胞生長仍然知之甚少。本研究中，高糖刺激MC3T3-E1 細(xì)胞，導(dǎo)致miR-495-3p 表達量減少，這說明在高糖條件下，miR-495-3p可能在成骨細(xì)胞功能中起重要作用。過表達miR-495-3p顯著提高高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞存活率、CyclinD1表達量，降低細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平，證明miR-495-3p促進高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，這與黃芪總皂苷的效果相似。在MC3T3-E1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-495-3p，進一步考察TSA保護高糖損傷成骨細(xì)胞的機制，發(fā)現(xiàn)低表達miR-495-3p可以逆轉(zhuǎn)TSA促進高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1 增殖作用和抑制其凋亡作用，表明調(diào)控miR-495-3p可能是黃芪總皂苷發(fā)揮保護高糖損傷成骨細(xì)胞功能的重要機制之一。

綜上所述，黃芪總皂苷可以改善高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷，抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡，其作用機制與調(diào)控miR-495-3p 表達有關(guān)，這為理解糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的機制提供了理論基礎(chǔ)，也為黃芪的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了新思路。但是關(guān)于黃芪總皂苷保護高糖損傷成骨細(xì)胞的具體機制有待于進一步探索。