金海燕，廖成俊，包雪鸚，李冕動，賴金玉，張惠光

作者單位：1深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳518000；2解放軍九六四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130000

偏頭痛是一種臨床常見慢性神經(jīng)血管性疾病，病情復(fù)雜，易反復(fù)發(fā)作，伴有惡心、嘔吐等先兆癥狀，發(fā)病率約7%～11%，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量。目前臨床主要采用曲普坦類藥物、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）1B/1D 受體拮抗劑等進(jìn)行治療，但效果不佳，不能從根本上進(jìn)行治療，且對心血管系統(tǒng)有一定副作用，因此尋找新型治療方案至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，清腦止痛膠囊（qingnaozhitong capsules，QNZT）可有效緩解大鼠偏頭痛癥狀，可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，改善腦、血管功能障礙有關(guān)，但涉及相關(guān)通路及具體機制尚不完全清楚。目前偏頭痛發(fā)病機制中以三叉神經(jīng)-血管學(xué)說占主導(dǎo)地位，該學(xué)說主要認(rèn)為偏頭痛發(fā)作與血管擴張、神經(jīng)炎性反應(yīng)密切相關(guān)。5-HT和一氧化氮（nitric oxide，NO）等分子可刺激神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種經(jīng)典炎癥信號通路，可參與環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase2，COX2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種炎癥介質(zhì)表達(dá)調(diào)控，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可利用NO自由基，協(xié)助巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中對抗病原體，與偏頭痛發(fā)生機制有關(guān)?；诖耍狙芯繑M探究QNZT對偏頭痛大鼠NF-κB/iNOS/COX2信號通路及痛覺敏感性的影響，以期進(jìn)一步揭示其可能作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

90 只健康雄性SPF 級Wistar 大鼠，體質(zhì)量范圍180～220 g，合格證號SCXK（吉）-2017-0003，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。（24±2）℃溫度、60%～70%濕度，12 h/12 h 光照/黑暗，自由飲水飲食環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。研究起止時間為2019年2—6月。本研究對動物處置符合動物倫理學(xué)原則（動物倫理編號為20170920601）。

1.2 藥品、試劑及主要儀器

清腦止痛膠囊（吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司，批號Z20080035，批次180625）；正天丸（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號Z44020711，批次181119）；硝酸甘油（nitroglycerin，NTG）注射液（河南潤弘制藥股份有限公司，批號H20057216，批次180314）；大鼠iNOS ELISA 檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，貨號ZK-R3047）；大鼠NO ELISA檢測試劑盒（上海滬震實業(yè)有限公司，貨號hz-7309）；兔源anti-iNOS（貨號ab353）、anti-NF-kB p65（貨號ab207297）、anti-COX2（貨號ab15191）、anti-GAPDH 抗體（貨號ab181602）、二抗羊抗兔IgG（貨號ab6721），均購自英國Abcam公司；熱刺痛儀，購自上海軟隆科技發(fā)展有限公司；EPOCH微孔分光光度計購自美國Bio Tek公司；ESJ60-4電子天平購自沈陽龍騰電子有限公司；Tanon-4200自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Tanon公司等。

1.3 方法

1.3.1

造模與分組 90 只大鼠隨機分為6 組：空白組（NC組）、模型組（M 組）、陽性藥物正天丸組（ZTW組，0.006 g/kg）、清腦止痛膠囊低（QNZT-L組，0.35 g/kg）、中（QNZT-M 組，0.70 g/kg）、高（QNZT-H 組，1.40 g/kg）劑量組，每組15只。以生理鹽水溶解清腦止痛膠囊及正天丸，分別配置為0.035、0.070、0.140 g/mL的清腦止痛藥液及0.000 6 g/mL 正天丸藥液，藥物處理組大鼠按10 mL/kg 的劑量進(jìn)行灌胃，空白組、模型組以等量生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h 后，空白組于右肩皮下注射等量生理鹽水，其余5 組注射10 mg/kg NTG 注射液復(fù)制偏頭疼大鼠模型，當(dāng)大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、撓頭，爬籠活動明顯增加等行為時，表示造模成功。

1.3.2

各組大鼠行為學(xué)評分 造模成功后，記錄各組大鼠在連續(xù)30 min內(nèi)撓頭、爬籠、咬尾及往返運動次數(shù)，每個癥狀出現(xiàn)1次記1分，共分0～30 min，60～90 min，120～150 min共3個時間段（造模成功記為0 min）。

1.3.3

各組大鼠痛覺閾值檢測 分別將各組大鼠置于（55±5）℃熱刺痛儀上，即開始計時，至大鼠出現(xiàn)抬足或縮足反應(yīng)截止，這段時間記為大鼠痛覺閾值，規(guī)定60 s為最高痛覺閾值，≥60 s者均記為60 s。分別測定大鼠在造模成功后30 min、90 min、150 min痛覺閾值。

1.3.4

大鼠腦組織中NO、5-HT 水平檢測 造模4 h后，2%異戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死，斷頭獲得大腦，剪取0.5 g 腦組織置于液氮中保存?zhèn)溆?，另?.5 g制備腦組織勻漿液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠腦組織中一氧化氮（NO）、5-HT 水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5

大鼠腦組織NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量檢測 采用免疫印跡法（western blot）檢測1.3.4中采集的各組大鼠腦組織中NF-κB p65、iNOS、COX2蛋白表達(dá)量。采用蛋白抽提試劑盒提取腦組織總蛋白和細(xì)胞核蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品進(jìn)行6%SDS-PAGE電泳2 h，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別添加一抗anti-NF-kB p65（1∶200）、anti-iNOS（1∶400）、anti-COX2（1∶400）、anti-GAPDH（1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，加入二抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，洗膜，顯色，曝片，于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分比較

NC 組大鼠未見異常行為學(xué)改變。在造模成功后0～150 min 內(nèi)，與NC組比較，M 組、ZTW 組、QNZT-L 組、QNZT-M 組、QNZT-H 組大鼠均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，撓頭次數(shù)增加，爬籠活動明顯等行為，行為學(xué)評分增加（

P＜

0.05）；與M組比較，ZTW 組、QNZT-L、QNZT-M 組、QNZT-H 組大鼠撓頭、爬籠次數(shù)減少，行為學(xué)評分降低（

P

＜0.05），其中QNZT-M 組、QNZT-H 組上述各指標(biāo)均優(yōu)于QNZTL 組（

P＜

0.05），而QNZT-M 組與QNZT-H 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評分比較/（分，±s）

2.2 各組大鼠痛覺閾值比較

與NC組比較，M組大鼠痛覺閾值降低（

P

＜0.05）；與M組比較，ZTW組、QNZT-L組、QNZT-M組、QNZT-H組大鼠痛覺閾值增加（

P

＜0.05）；QNZT-M 組、QNZT-H 組大鼠痛覺閾值高于QNZT-L 組（

P

＜0.05），QNZT-M 組與QNZT-H 組大鼠痛覺閾值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腦組織中NO、5

-

HT 含量比較

與NC 組比較，M 組大鼠腦組織中NO 含量增加、5-HT含量降低（

P

＜0.05）；與M 組比較，ZTW 組、QNZT-L組、QNZT-M組、QNZT-H組大鼠腦組織中NO含量降低、5-HT 含量升高（

P

＜0.05）；QNZT-M 組、QNZT-H組大鼠腦組織中NO 含量低于QNZT-L 組（

P

＜0.05），5-HT 含量高于QNZT-L 組（

P

＜0.05），QNZT-M 組、QNZT-H組大鼠腦組織中NO含量、5-HT含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P＞

0.05）。見表3。

表2 各組大鼠痛覺閾值比較/（s，±s）

表3 各組大鼠腦組織中NO、5-HT含量比較/±s

2.4 各組大鼠腦組織NF

-κ

B p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量比較

與NC 組比較，M 組大鼠腦組織NFκB p65、iNOS、COX2蛋白表達(dá)量升高（

P

＜0.05）；與M組比較，ZTW 組、QNZT-L組、QNZT-M組、QNZT-H組大鼠腦組織中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量降低（

P

＜0.05），QNZT-M 組、QNZT-H 組大鼠腦組織中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量低于QNZT-L組（

P

＜0.05），QNZT-M 組與QNZT-H 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。詳見表4，圖1。

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB p65、iNOS、COX2蛋白表達(dá)量比較/±s

圖1 WB檢測大鼠腦組織NF-κB p65、iNOS、COX2蛋白表達(dá)量

3 討論

偏頭痛模型目前公認(rèn)的有NTG 致偏頭痛模型、利血平化低5-HT伴局部腦血管痙攣致偏頭痛模型、硬膜腦神經(jīng)炎偏頭痛模型等，其中NTG 可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO、iNOS 等因子，引起血管擴張，激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致血管炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)偏頭痛，與人類偏頭痛生理過程最為相似。本研究采用皮下注射NTG 的方法復(fù)制偏頭痛大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，注射NTG 后大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，撓頭、爬籠等行為學(xué)反應(yīng)，行為學(xué)評分增加，表明偏頭痛大鼠模型制備成功，可用于后續(xù)試驗。

在中醫(yī)中偏頭痛屬“頭風(fēng)”范疇，多由外感、情志、內(nèi)傷等引起，目前臨床上尚無特效藥，近來研究報道，較西醫(yī)療法中醫(yī)治療優(yōu)勢明顯。QNZT由天麻、蒺藜、川芎、枸杞子、牛膝、香附、丹參、熟地黃、藁本、細(xì)辛組成，是一種中藥復(fù)方制劑，其中天麻為君藥，味甘性平，專入肝經(jīng)，擅平肝火，清利頭目；川芎為臣藥，可升清開郁，活血止痛；配伍蒺藜可環(huán)周顱腦，增強除風(fēng)止痛之效；佐以丹參活血化瘀、牛膝活血通絡(luò)、香附理氣解郁，復(fù)以枸杞子、熟地黃補肝養(yǎng)腎，可曲風(fēng)清腦，化瘀止痛，且無不良反應(yīng)，不產(chǎn)生依賴性。孫申國等研究發(fā)現(xiàn)，QNZT可減少老年偏頭痛患者頭痛發(fā)作，改善其惡心、嘔吐等癥狀，且安全性好，另外QNZT 可降低大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、COX2水平，緩解利血平致大鼠偏頭痛癥狀。偏頭痛發(fā)病機制學(xué)說中以三叉神經(jīng)學(xué)說占主導(dǎo)地位，三叉神經(jīng)激活誘發(fā)的腦內(nèi)炎癥可引起頭痛發(fā)作及痛覺超敏反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)NO具有神經(jīng)毒性，可引發(fā)三叉神經(jīng)-血管反射，導(dǎo)致實驗性偏頭痛，5-HT受體激動劑可激動中樞5-HT受體，終止偏頭痛急性發(fā)作。吳莎等研究報道，川芎-香附可通過升高NTG偏頭痛大鼠5-HT水平，降低NO、NOS釋放，發(fā)揮治療偏頭痛作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與M 組比較，QNZT-L 組、QNZT-M組、QNZT-H組大鼠行為學(xué)評分、腦組織NO水平降低，腦組織5-HT水平、痛覺閾值升高，QNZT-M組、QNZTH 組大鼠腦組織5-HT 水平、痛覺閾值高于QNZT-L組，行為學(xué)評分、腦組織NO水平低于QNZT-L組，QNZT-M組與QNZT-H組大鼠各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明QNZT可降低偏頭痛大鼠行為學(xué)評分、腦組織NO水平，升高其腦組織5-HT水平、痛覺閾值，減輕偏頭痛癥狀，并在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性，進(jìn)一步證實了以前的研究結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 信號通路參與偏頭痛發(fā)病機制，NF-κB由p65與p50以不同形式存在的異源二聚體，活化后的NF-κB p65 由胞漿轉(zhuǎn)入胞核發(fā)揮生物學(xué)活性，進(jìn)一步激活iNOS，使腦血管擴張，血漿外滲，誘發(fā)神經(jīng)性無菌性炎癥，NO、TNF-α、COX2 等可作為NF-κB信號通路上游促炎因子刺激NF-κB信號通路激活。蒲玉婷等研究報道，顱痛顆?？赡芡ㄟ^下調(diào)NTG 致偏頭痛大鼠腦干組織IL-1β、TNF-α、COX-2 表達(dá)，改善偏頭痛大鼠行為學(xué)改變，但QNZT是否可調(diào)控偏頭痛大鼠腦組織NF-κB p65/iNOS/COX2 信號傳導(dǎo)目前還不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，M 組大鼠腦組織NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量升高；與M 組比較，QNZT-L 組、QNZT-M 組、QNZT-H 組大鼠腦組織中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量降低，QNZT-M 組、QNZT-H組大鼠腦組織中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量低于QNZT-L 組，QNZT-M 組與QNZT-H 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明QNZT 可降低NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表達(dá)量，抑制NF-κB p65/iNOS/COX2信號通路激活，緩解NTG 致大鼠偏頭痛癥狀，升高其痛覺閾值，并在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

綜上所述，QNZT 可降低NO 水平、升高5-HT 水平，緩解偏頭痛大鼠頭痛發(fā)作，升高其痛覺閾值，改善其臨床癥狀，并在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性，抑制NF-κB/iNOS/COX2 信號通路激活可能是其藥理機制。但NF-κB/iNOS/COX2 通路涉及信號因子較多，本研究未能一一檢測各因子表達(dá)變化，尚存在不足，有待進(jìn)一步深入探究。