王曉陽(yáng)，謝愛(ài)敏，郎少磊

作者單位：三門峽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河南 三門峽472000

胃癌是臨床多發(fā)且死亡率居高不下的惡性腫瘤，早期胃癌手術(shù)治療預(yù)后較好，但晚期胃癌5年生存率僅為24%，因此胃癌的早期診斷是減少其死亡率的關(guān)鍵。目前胃內(nèi)鏡檢查是胃癌診斷的可靠工具，但其價(jià)格昂貴且具有一定侵入性，在胃癌的一線篩查應(yīng)用中受限。血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)因其方便、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)被逐漸用于癌癥的早期診斷及篩查中，但目前常見(jiàn)的血清腫瘤標(biāo)志物診斷靈敏度及特異度較低，亟需尋找更有效的胃癌診斷標(biāo)志物或方法。胃癌的發(fā)生及發(fā)展是多因素共同作用的復(fù)雜過(guò)程，其中遺傳因素及環(huán)境因素發(fā)揮重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，在細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖及凋亡中均發(fā)揮重要功能。微小RNA-200C（microRNA-200C，miR-200C）、微小RNA-101（microRNA-101，miR-101）是已在惡性腫瘤方面有一定研究基礎(chǔ)的miRNA，大量研究表明其可調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程，參與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為過(guò)程。除miRNA，部分決定組織生物學(xué)特性的分子也在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，肝腸鈣黏蛋白（enterohepatic cadherin，CDH17）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的鈣黏蛋白超家族成員，與細(xì)胞黏附及EMT作用相關(guān)，在維持腸道上皮細(xì)胞完整性方面發(fā)揮一定作用，與胃癌的發(fā)生及發(fā)展有一定關(guān)系。目前已有部分研究開(kāi)展了胃癌病人血清miR-200C、miR-101、CDH17等因子變化的研究，但這些因子對(duì)胃癌的診斷價(jià)值仍有待大樣本數(shù)據(jù)支持。本研究比較了胃癌、胃良性疾病病人及健康受試者miR-200C、miR-101、CDH17差異，分析其診斷價(jià)值，并與糖類抗原72-4（carbohydrate antigen72-4，CA72-4）等常見(jiàn)標(biāo)志物診斷價(jià)值進(jìn)行比較，并探討多指標(biāo)聯(lián)合診斷的可行性，旨在為胃癌的早期準(zhǔn)確診斷提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年2月三門峽市中心醫(yī)院收治的150 例胃癌病人納入胃癌組，所有病人均經(jīng)病理檢查確診，排除合并全身系統(tǒng)性疾病、其他良惡性腫瘤者及已接受放化療等輔助治療措施者。另選擇該院同期收治的50 例胃良性疾病病人及50例健康體檢者，分別納入良性組及對(duì)照組，其中胃良性疾病者為經(jīng)胃鏡檢查確診的慢性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍病人，健康體檢者經(jīng)完整的體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查，排除其他系統(tǒng)疾病及良惡性腫瘤。經(jīng)比較，三組受試者性別組成、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 胃癌病人150例、胃良性疾病50例及健康體檢者50例一般資料比較

1.2 方法

實(shí)時(shí)熒光定量-反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)miR-200C、miR-101表達(dá)：①總RNA提取。采集病人外周靜脈血，離心分離血清，吸取上清保存?zhèn)溆?。?00 μL 血清置于1.5 mL 離心管內(nèi)，采用Trizol 試劑提取RNA，DEPC 水溶解，采用1%甲醛變性膠檢測(cè)RNA 完整性及質(zhì)量，保存?zhèn)溆?。②逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。采用micro RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL：10×RT buffer 1.5 μL，100 mmol/L dNTPs 0.15 μL，50 U/μL Reverse Transcriptase 1.0 μL，20 U/μL RNA 酶抑制劑0.19 μL，1 μmol/L 逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μL，RNA 模板1 μL，DEPC 水補(bǔ)足。③PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：TaqMan GE MASTER Mix 10 μL、RT 產(chǎn)物1 μL、RT 特異性引物1μl、補(bǔ)DEPC 水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 Cycle。miR-200C 特異性引物：正向引物（TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG），反向引物（GCGAGCACAGAATTAATACGAC）。miR-101 特異性引物：正向引物（TGGGCTACAGTACTGTGATA）；反向引物（TGCGTGTCGTGGAGTC）。內(nèi)參U6特異性引物：正向引物（5’-CATTGCACTTGTCTCGGTCT-3’）；反向引物（5’-GGTCCGAGGTATTCGCACT-3’）。④結(jié)果計(jì)算：以U6 擴(kuò)增作為參照，測(cè)定循環(huán)閾值（Ct 值），計(jì)算ΔCt 值，ΔCt=目的擴(kuò)增Ct 值-內(nèi)參Ct值，以2表示為目的產(chǎn)物的表達(dá)水平。

CDH17 和CA72-4 濃度檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清CDH17濃度，實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；CA72-4采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定，試劑購(gòu)自羅氏公司。

2 結(jié)果

2.1 各組受試者血清miR

-

200C、miR

-

101、CDH17、CA72

-

4 表達(dá)情況

各組血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4 表達(dá)水平差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），胃癌組病人血清miR-200C、miR-101 表達(dá)水平顯著低于良性組及對(duì)照組，CDH17、CA72-4 水平顯著高于良性組及對(duì)照組（

P

＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 胃癌病人150例、胃良性疾病50例及健康體檢者50例血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4表達(dá)情況比較

2.2 血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4表達(dá)水平與胃癌病理參數(shù)之間的關(guān)系

血清miR-200C、miR-101、CDH17 與胃癌病人浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、臨床分期相關(guān)（

P

＜0.05）；CA72-4與胃癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（

P

＜0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 血清學(xué)指標(biāo)單獨(dú)用于胃癌診斷的價(jià)值分析

各腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)診斷胃癌，miR-200C、miR-101、CDH17 及CA72-4 診斷胃癌的曲線下面積分別為0.899、0.904、0.871、0.793；其中miR-101 診斷曲線下面積最大，當(dāng)截點(diǎn)值為0.46 時(shí)，其診斷靈敏度、特異度分別為82.3%、82.1%。詳見(jiàn)圖1、表4。

圖1 各腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)診斷胃癌的ROC曲線

表4 各腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)診斷胃癌的診斷效能

2.4 血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的價(jià)值分析

miR-200C、miR-101、CDH17 分別聯(lián)合CA72-4 診斷胃癌的曲線下面積為0.956、0.947、0.961，四種聯(lián)合診斷曲線下面積最大，其靈敏度、特異度分別為97.6%、90.6%。詳見(jiàn)圖2、表5。

圖2 血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的ROC曲線

表5 不同指標(biāo)組合對(duì)胃癌的診斷效能分析

3 討論

研究證實(shí)，miRNA 可通過(guò)與靶基因3’非編碼區(qū)或開(kāi)放閱讀框互補(bǔ)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)表達(dá)；在腫瘤方面，miRNA 與多種原癌基因、抑癌基因表達(dá)相關(guān)，可影響腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展。miR-200C、miR-101 為抑癌基因的miRNA，miRNA-200C是存在于多種腫瘤組織及細(xì)胞的miRNA，研究報(bào)道其在消化道癌、乳腺癌等諸多腫瘤組織中均存在異常表達(dá)。miRNA-101 的成熟形式由miRNA-101-1 及miRNA-101-2 兩種形式構(gòu)成，研究表明其可參與EMT 過(guò)程，EMT 的發(fā)生導(dǎo)致鈣黏附蛋白E表達(dá)下調(diào)，減少細(xì)胞間的黏附，加速癌細(xì)胞的擴(kuò)散及侵襲；miRNA-101 的低表達(dá)也可促進(jìn)EZH2 表達(dá)升高，導(dǎo)致鈣黏蛋白E 表達(dá)通路障礙。Lv 等開(kāi)展的一項(xiàng)研究證實(shí)，肺癌組織miRNA-101 表達(dá)缺失時(shí)，也導(dǎo)致COX-2 等基因的高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞血管生成，促進(jìn)其進(jìn)展。EMT 的激活與腫瘤發(fā)生、侵襲性密切相關(guān)，EMT 相關(guān)調(diào)節(jié)因子可能可為惡性腫瘤的診斷提供一定參考。CDH17為鈣黏蛋白家族成員，雖然與其他成員有結(jié)構(gòu)及功能上的區(qū)別，但其也與胚胎的發(fā)生、發(fā)育及器官形成、維持等過(guò)程密切相關(guān)。既往一項(xiàng)基因芯片及表達(dá)分析技術(shù)研究顯示，胃癌病人中CDH17 RNA 表達(dá)可出現(xiàn)顯著性上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組及良性組比較，胃癌病人血清miRNA-200C、miRNA-101 水平較低，CDH17 水平較高，且其表達(dá)程度與胃癌病人臨床病理參數(shù)相關(guān)，浸潤(rùn)程度越高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人miRNA-200C、miRNA-101 水平更低，CDH17 水平更高，提示miRNA-200C、miRNA-101 可能參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。

表3 胃癌病人150例血清miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4表達(dá)水平與胃癌病理參數(shù)之間的關(guān)系

目前miR-200C、miR-101、CDH17 在胃癌中的表達(dá)量已有部分研究報(bào)道，但各指標(biāo)對(duì)胃癌的診斷價(jià)值研究報(bào)道較少，加之各研究檢測(cè)方法差異及納入對(duì)象的差異，各研究得到的診斷截點(diǎn)值及診斷效能有較大差異。本研究將這3種相對(duì)新穎的指標(biāo)與臨床常見(jiàn)的血清腫瘤標(biāo)志物CA72-4的診斷價(jià)值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，三者診斷胃癌的曲線下面積為0.899、0.904、0.871，高于CA72-4 診斷（0.793），提示這三種標(biāo)志物可能對(duì)于胃癌有更高的診斷效能。另外本研究探討了miR-200C、miR-101、CDH17分別與CA72-4聯(lián)合及多者聯(lián)合診斷的價(jià)值，結(jié)果顯示miR-200C、miR-101、CDH17 分別聯(lián)合CA72-4 診斷胃癌的曲線下面積為0.956、0.947、0.961，四種聯(lián)合診斷曲線下面積最大，曲線下面積高達(dá)0.995，提示多者聯(lián)合可提高胃癌的診斷效能?？紤]到臨床檢測(cè)miR-200C、miR-101過(guò)程復(fù)雜，多種指標(biāo)聯(lián)合用于篩查可能較為困難，臨床上可選用兩種指標(biāo)聯(lián)合提高疾病的診斷。

綜上所述，miR-200C、miR-101、CDH17、CA72-4對(duì)胃癌有一定診斷效能，相比于常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物CA72-4，miR-200C、miR-101、CDH17診斷價(jià)值更高，臨床上可通過(guò)聯(lián)合多種指標(biāo)共同診斷以提高診斷準(zhǔn)確度；盡管血清學(xué)指標(biāo)對(duì)于胃癌有一定診斷價(jià)值，但其仍存在較多誤診漏診，僅具有初篩價(jià)值，在臨床上宜結(jié)合臨床癥狀、內(nèi)鏡檢查方式，對(duì)于可疑病例最終應(yīng)以病理學(xué)診斷為準(zhǔn)。