李麗英，李海燕，陳海燕

作者單位：安陽市婦幼保健院兒科，河南 安陽455000

支氣管哮喘是臨床常見的一種氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病與遺傳、免疫等因素密切相關(guān)，在發(fā)病過程中有多種基因或細(xì)胞因子參與。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA））是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200nt 的RNA 分子的RNA，雖然不具備蛋白的編碼功能，但能夠在多層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。在支氣管哮喘發(fā)病過程中，LncRNA能夠通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等從而參與支氣管哮喘發(fā)生及發(fā)展過程。長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3（Long noncoding RNAmaternally expressed gene 3，LncRNA MEG3）具有多樣的生物調(diào)節(jié)功能，對(duì)細(xì)胞的凋亡及增殖、淋巴細(xì)胞的分化及炎性介質(zhì)的表達(dá)均具有調(diào)控作用，并且在惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及心血管疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程中具有重要的作用。支氣管哮喘的發(fā)病及進(jìn)展與免疫功能異常、炎性介質(zhì)的持續(xù)釋放關(guān)系密切，推測(cè)LncRNA MEG3對(duì)免疫功能及炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能在支氣管哮喘的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮作用，但目前LncRNA MEG3在小兒支氣管哮喘的發(fā)病及進(jìn)展中的作用尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。因此本研究檢測(cè)支氣管哮喘病兒外周血單核細(xì)胞中LncRNAMEG3的表達(dá)并分析其與病兒肺功能、免疫功能的相關(guān)性，旨在探討LncRNA MEG3在支氣管哮喘發(fā)病中的作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月至2018年9月安陽市婦幼保健院收治的支氣管哮喘病兒60例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組2016年發(fā)布的《兒童支氣管哮喘診斷和防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，（2）支氣管哮喘病兒近期1 周內(nèi)未服用茶堿、糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑等影響肺功能的藥物，（3）病兒近親屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病病兒；合并自身免疫性疾病病兒；既往惡性腫瘤病史。病兒入選后按病情分組，根據(jù)病兒發(fā)作時(shí)嚴(yán)重程度分為輕度組（輕度持續(xù)發(fā)作，20 例），中度組（中度持續(xù)發(fā)作，20例），重度組（重度持續(xù)發(fā)作，20 例）。同時(shí)選取同期體檢的健康兒童40 例作為對(duì)照組。各組受試者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P＞

0.05），具有可比性。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

表1 支氣管哮喘病兒60例及健康兒童40例一般資料比較

1.2 肺功能檢測(cè)

應(yīng)用MS-IOS型肺功能檢測(cè)儀（德國(guó)JAEGER 公司）檢測(cè)各組受檢兒童的肺功能指標(biāo)，主要包括第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%），第1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比（FEV1/FVC）、最大呼氣峰流速占預(yù)計(jì)值百分比（PEF%）。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1

標(biāo)本采集 清晨采集各組受檢兒童空腹靜脈血4 mL，血液樣本分為兩部分，一部分血液樣本置于非抗凝試管中，室溫放置2 h，4 ℃條件下1 200 r/min 離心15 min，吸取血清置于-80 ℃超低溫冰箱保存。另一部分血液樣本置于EDTA 抗凝試管中，采用Ficoll 密度梯度離心法提取外周血單核細(xì)胞，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.2

LncRNA MEG3 水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time PCR，qRTPCR）檢測(cè)單核細(xì)胞LncRNAMEG3的表達(dá)水平，Trizol（美國(guó)Invitogen 公司）法提取單核細(xì)胞中的總RNA，Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。MEG3 正 向 引 物5’-GGGCTTCTGGAATGAGCATG-3’，反向引物5’-TCTATGCCAG ATCCTGCCTG-3’；GAPDH 正 向 引 物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄體系（北京天根生化科技有限公司）：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free 雙蒸水補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（北京天根生化科技有限公司）：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free 雙蒸水補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循環(huán)40次），置于ABI 7500型熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）檢測(cè)，記錄各組Ct 值，ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）=Ct（實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因）-Ct（實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因），ΔCt（對(duì)照組）=Ct（對(duì)照組目標(biāo)基因）-Ct（對(duì)照組內(nèi)參），MEG3以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計(jì)算LncRNAMEG3的表達(dá)量。

1.3.3

免疫功能指標(biāo)及炎性介質(zhì)檢測(cè) 應(yīng)用IMMAGE800全自動(dòng)特定蛋白分析儀（美國(guó)貝克曼庫爾特公司）檢測(cè)免疫球蛋白E（IgE）水平；應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（北京寶靈曼陽光科技有限公司）檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血單核細(xì)胞中LncRNA MEG3 的表達(dá)

重度組，中度組及輕度組LncRNA MEG3 表達(dá)水平高于對(duì)照組[（0.30±0.07）、（0.42±0.06）、（0.67±0.10）比（1.01±0.13）］（

P

＜0.05），重 度 組LncRNA MEG3 表達(dá)水平高于中度組及輕度組（

P

＜0.05）[（0.30±0.07）比（0.42±0.06）、（0.67±0.10）］，中度組LncRNA MEG3 表 達(dá) 水 平 高 于 輕 度 組（

P

＜0.05）[（0.42±0.06）比（0.67±0.10）］，。

2.2 各組受檢者肺功能比較

重度組FEV1，F(xiàn)EV1/FVC及PEF低于中度組、輕度組及對(duì)照組（

P

＜0.05），中度組FEV1，F(xiàn)EV1/FVC 及PEF 低于輕度組及對(duì)照組（

P

＜0.05），輕度組FEV1，F(xiàn)EV1/FVC及PEF低于對(duì)照組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 支氣管哮喘病兒60例及健康兒童40例受檢者肺功能比較/±s

2.3 各組受檢者免疫功能指標(biāo)比較

重度組，中度組及輕度組IgE、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平、IL-4、IL-17A 水平高于對(duì)照組（

P

＜0.05），重度組IgE、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平、IL-4、IL-17A水平高于中度組及輕度組（

P

＜0.05），中度組IgE、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平、IL-4、IL-17A水平高于輕度組（

P

＜0.05）。重度組、中度組及輕度組IFN-γ、TGF-β 低于對(duì)照組（

P

＜0.05），重度組IFN-γ、TGF-β低于中度組及輕度組（

P

＜0.05），中度組IFN-γ、TGF-β低于輕度組（

P

＜0.05）。見表3。

表3 支氣管哮喘病兒60例及健康兒童40例免疫功能指標(biāo)比較/±s

2.4 支氣管哮喘病兒LncRNA MEG3表達(dá)量與肺功能、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)分析支氣管哮喘病兒MEG3表達(dá)量與肺功能的相關(guān)性，結(jié)果顯示MEG3表達(dá)量與FEV1、FEV1/FVC、PEF%呈正相關(guān)（

P

＜0.05），采用Pearson 相關(guān)分析支氣管哮喘病兒MEG3表達(dá)量與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示MEG3表達(dá)量與IgE、IL-4、IL-17A呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.05），而與IFN-γ、TGF-β呈正相關(guān)（

P

＜0.05）。見表4。

2.5 多因素綜合分析

--

LncRNA MEG3 表達(dá)量與病情嚴(yán)重程度、肺功能、免疫功能的關(guān)聯(lián)影響關(guān)系

建立多元線性回歸模型，以觀察組（支氣管哮喘病兒）資料為樣本，以LncRNA MEG3 表達(dá)量為應(yīng)變量，以病情嚴(yán)重程度、肺功能（以FEV1/FVC 表征之）、免疫功能（以IgE 表征之）等3 個(gè)指標(biāo)/因素為自變量（說明：樣本量較少，肺功能及免疫功能，按臨床專家建議，僅以代表性指標(biāo)表征之）?；貧w過程采用最優(yōu)子集法。默認(rèn)建立

R

極大選擇模型，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除?；貧w結(jié)果：最優(yōu)子集即全子集，3 個(gè)變量均被保留入回歸方程（P＜0.05）。提示：病情嚴(yán)重程度、肺功能、免疫功能與LncRNA MEG3表達(dá)量有密切的關(guān)聯(lián)影響關(guān)系。見表5。

3 討論

支氣管哮喘主要臨床表現(xiàn)為氣道慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性，其發(fā)生過程與遺傳、表觀遺傳學(xué)因素等有關(guān)，LncRNA可調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)從而參與支氣管哮喘等多種疾病發(fā)生過程，還可作為疾病早期篩選的分子標(biāo)志物。因而本研究積極探尋新型LncRNA并分析其與支氣管哮喘病兒肺功能、免疫功能的相關(guān)性，為哮喘的診斷提供新的分子標(biāo)志物。

LncRNAMEG3是在組織中廣泛表達(dá)的非編碼長(zhǎng)鏈RNA，雖然不具備蛋白編碼功能，但是其能夠多種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后過程進(jìn)行調(diào)控，其最早被發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中低表達(dá)，并且其表達(dá)降低的程度與腫瘤的侵襲性及進(jìn)展有關(guān)。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3對(duì)免疫細(xì)胞及炎性介質(zhì)的釋放具有調(diào)控作用。如在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)MEG3表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞炎癥及細(xì)胞凋亡。有報(bào)道指出LncRNAMEG3可參與多種炎性疾病發(fā)生過程。在本研究中亦發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘病兒?jiǎn)魏思?xì)胞中LncRNAMEG3的表達(dá)水平降低，并且其降低的程度與病情相關(guān)，病情越重的病兒LncRNAMEG3下降的越明顯，提示在小兒支氣管哮喘的進(jìn)展中，LncRNAMEG3發(fā)揮了調(diào)控作用。

支氣管哮喘的發(fā)病與多因素有關(guān)，其中免疫功能異常及炎性介質(zhì)的釋放具有重要的作用，在支氣管哮喘的發(fā)病過程中，細(xì)胞免疫及體液免疫均處于失衡狀態(tài)，加之肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的聚集及炎性介質(zhì)的釋放，使氣道處于慢性炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致氣道的高反應(yīng)性，在外來抗原的刺激下，誘發(fā)氣道的痙攣，導(dǎo)致支氣管哮喘的發(fā)作[17］。本研究顯示，IgE、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平、IL-4、IL-17A 水平顯著升高，IFN-γ、TGF-β 水平顯著降低，呼吸道是IgE 表達(dá)的部位之一，由漿細(xì)胞產(chǎn)生，能夠誘發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)生。在支氣管哮喘的發(fā)作過程中，輔助型T 細(xì)胞1（Th1）與輔助型T 細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞分泌水平失衡哮喘進(jìn)展的重要原因[18］。相關(guān)報(bào)道指出IFN-γ 是Th1 細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，IL-4 是Th2 細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，IL-17A 是輔助型T細(xì)胞17（Th17）的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，TGF-β是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，研究表明Th1、Th2、Th17、Treg 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與多種炎癥性疾病發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)[19］。IL-4、IL-17A 及IFN-γ 水平的變化，提示在支氣管哮喘兒童，Th1/Th2 免疫飄逸，導(dǎo)致其下游的炎性介質(zhì)的表達(dá)異常，參與支氣管哮喘的進(jìn)展。而TGF-β 能夠誘導(dǎo)Th0細(xì)胞的分化方向，對(duì)其下游的炎性介質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與支氣管哮喘的發(fā)病及進(jìn)展。

表4 支氣管哮喘60例LncRNA MEG3表達(dá)量與肺功能、免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性

表5 支氣管哮喘60例病情嚴(yán)重程度、肺功能、免疫功能與LncRNA MEG3表達(dá)量的多元線性回歸結(jié)果

在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，在小兒支氣管哮喘病兒，LncRNAMEG3的表達(dá)水平與IgE、IL-4、IL-17A呈負(fù)相關(guān)，而與IFN-γ、TGF-β 呈正相關(guān)，與FEV1，F(xiàn)EV1/FVC 及PEF 呈現(xiàn)正相關(guān)，病情嚴(yán)重程度、肺功能、免疫功能與LncRNA MEG3 表達(dá)量有密切的關(guān)聯(lián)影響關(guān)系。提示LncRNAMEG3 能夠反應(yīng)病兒肺部的功能狀態(tài)，其可能通過對(duì)免疫因子及炎性介質(zhì)的釋放的調(diào)控而參與支氣管哮喘的發(fā)生及進(jìn)展。

綜上所述，MEG3在支氣管哮喘病兒外周血單核細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可能參與哮喘發(fā)生及發(fā)展過程，可作為早期診斷哮喘及監(jiān)控疾病進(jìn)展的分子標(biāo)志物，對(duì)哮喘病兒預(yù)后的預(yù)判具有一定作用，其可能通過對(duì)免疫因子及炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。但LncRNAMEG3在支氣管哮喘發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未可知，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分子生物學(xué)探究。