黃燕，單麗，邱水生，潘旭東，林雄，羅花彩

作者單位：福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004

益腎降糖膠囊是由我院院內(nèi)制劑益腎降糖飲（閩藥制字Z061060503）劑型改革而得的復(fù)方制劑。該方是阮詩瑋教授總結(jié)古今文獻(xiàn)，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下自創(chuàng)的經(jīng)驗(yàn)方。其處方以制何首烏、赤芍、黃芩、太子參、黃芪、山藥、肉蓯蓉等14味藥材組成，具有滋陰養(yǎng)血、益腎通絡(luò)之功效。該制劑臨床應(yīng)用于腎氣虧虛、陰血虧損、脈絡(luò)瘀阻等特點(diǎn)的糖尿病腎病，能夠有效降低尿微量白蛋白，血漿同型半胱氨酸水平，延緩病情進(jìn)展的速度，臨床應(yīng)用幾十年，效果良好。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，只對(duì)方中黃芪、赤芍進(jìn)行薄層鑒別，無含量測(cè)定項(xiàng)目。因劑型由合劑改為膠囊劑，樣品處理方法不同，故本研究于2018年9月至2019年12月對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別項(xiàng)目進(jìn)行整合優(yōu)化，重新建立了制何首烏、赤芍、玄參、黃芪、山藥、黃芩的薄層色譜鑒別。方中制何首烏為君藥，具有補(bǔ)肝腎，益精血，烏須發(fā)，強(qiáng)筋骨，化濁降脂的作用，其專屬有效成分2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱二苯乙烯苷）具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、肝臟保護(hù)、防治老年癡呆等作用，常作為制何首烏質(zhì)控指標(biāo)成分。赤芍、黃芩為臣藥，赤芍的主要成分芍藥苷具有抗自由基損傷、降低血液黏度，抗血小板聚集，改善微循環(huán)、抗氧化等作用，黃芩的主要成分黃芩苷具有解熱抗炎、清除自由基、抗氧化、心腦血管保護(hù)等作用。制何首烏、赤芍、黃芩在益腎降糖膠囊中起至關(guān)重要作用，為了完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加了含量測(cè)定項(xiàng)目，采用高效液相色譜法對(duì)芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），WD-9403A 型紫外儀（北京市六一儀器廠），98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），CPA-225D 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），Ulit Mate-3000型高效液相色譜儀（戴安中國(guó)有限公司）。

1.2 試劑

制何首烏對(duì)照藥材（批次121454-201405），玄參對(duì)照藥材（批次121008-201609），山藥對(duì)照藥材（批次121137-201603），大黃素對(duì)照品（批次110756-200110，含量98.7%），芍藥苷對(duì)照品（批次110736-201842，含量97.4%），哈巴俄苷對(duì)照品（批次111730-201709，含量95.9%），黃芪甲苷對(duì)照品（批次110781-201717，含量96.9%），2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D 葡萄糖苷對(duì)照品（批次110844-201713，含量93.6%），黃芩苷對(duì)照品（批次110715-201720，含量93.5%），以上均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G層析板（批次20180908，青島海洋化工廠），甲醇（色譜純，批次20180422國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），其余試劑為分析純；益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108，20181110，0.43 克/粒，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院制劑室）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1

制何首烏的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內(nèi)容物10 g，加2.5 mol/L 硫酸和三氯甲烷各30 mL，搖勻，水浴加熱回流40 min，冷卻，取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷20 mL振搖提取，三氯甲烷提取液合并，水浴蒸干，用三氯甲烷溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，制成供試品溶液。另稱取制何首烏對(duì)照藥材0.2 g，照上述方法制備對(duì)照藥材溶液。取不含制何首烏的供試品，同法制備缺制何首烏的陰性對(duì)照溶液，再取大黃素對(duì)照品適量，加三氯甲烷溶解，制成每1毫升含0.5 mg大黃素的對(duì)照品溶液。取上述供試品、缺制何首烏陰性對(duì)照溶液各10 μL，對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液各5 μL，在同一硅膠G層析板上分別點(diǎn)樣，取甲苯—乙酸乙酯—甲酸（體積比為20∶2∶1）的上層溶液置層析缸中，預(yù)飽和15 min，薄層板展開至適宜高度，取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm）下觀察。薄層色譜中，供試品、對(duì)照品、對(duì)照藥材溶液色譜在薄層板相對(duì)應(yīng)的位置呈同樣的黃色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離良好，而陰性對(duì)照無同樣的干擾斑點(diǎn)。該法操作簡(jiǎn)單，具重現(xiàn)性，可用于方中制何首烏的鑒別。見圖1A。

2.1.2

赤芍、玄參的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內(nèi)容物10 g，加甲醇40 mL，搖勻，超聲提?。?00 W，40 kHz）30 min，離心，上清液水浴蒸干，用水20 mL 溶解殘?jiān)诱〈颊駬u提取2 次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，制成供試品溶液。另取玄參對(duì)照藥材1 g，照上述方法制備對(duì)照藥材溶液。分別取不含赤芍、不含玄參的供試品，同法制備缺赤芍、缺玄參的陰性對(duì)照溶液。再取哈巴俄苷、芍藥苷對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解，分別制成每1 毫升含1 mg 哈巴俄苷、芍藥苷的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品、對(duì)照藥材溶液各5 μL，供試品及缺玄參、缺赤芍的陰性對(duì)照溶液各10 μL，在同一硅膠G 層析板上分別點(diǎn)樣，以三氯甲烷—甲醇—水（體積比為12∶4∶1）的下層溶液為展開劑，薄層板展開至適宜高度，取出，自然晾干，5%香草醛硫酸溶液噴霧顯色，加熱至斑點(diǎn)顏色清晰，置日光燈下檢視。薄層色譜中，供試品與對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液色譜在相對(duì)應(yīng)的位置呈同樣顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離良好，而陰性對(duì)照溶液無同樣的干擾斑點(diǎn)。該法操作簡(jiǎn)單，具重現(xiàn)性，可用于方中赤芍與玄參的鑒別。見圖1B。

2.1.3

黃芪的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內(nèi)容物15 g，加甲醇30 mL，搖勻，超聲提?。?00 W，40 kHz）30 min，離心，上清液水浴蒸干，加水20 mL 溶解殘?jiān)?，用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，加氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次30 mL，棄去水液，取正丁醇提取液水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，制成供試品溶液。另取不含黃芪的供試品，同法制備缺黃芪的陰性對(duì)照溶液。再取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 毫升含1 mg黃芪甲苷的對(duì)照品溶液。取上述3種溶液各10 μL，在同一硅膠G層析板上分別點(diǎn)樣，以三氯甲烷—甲醇—水（13∶7∶2，

V/V/V

）的下層溶液為展開劑，展開至適宜高度，取出，自然晾干，用10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，加熱至斑點(diǎn)顏色清晰，置日光燈下觀察。薄層色譜中，供試品與對(duì)照品溶液色譜在相對(duì)應(yīng)位置呈同樣顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離良好，而陰性對(duì)照溶液無同樣顏色的干擾斑點(diǎn)。該法操作簡(jiǎn)單，具重現(xiàn)性，可用于方中黃芪的鑒別。結(jié)果見圖1C。

2.1.4

山藥的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內(nèi)容物10 g，加二氯甲烷30 mL，搖勻，回流加熱2 h，冷卻，離心，上清液水浴蒸干，用二氯甲烷溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，制成供試品溶液。另取山藥對(duì)照藥材2 g，照上述方法制備對(duì)照藥材溶液。取不含山藥的供試品，同法制備缺山藥的陰性對(duì)照溶液。取上述溶液各10 μL，在同一硅膠G 層析板上分別點(diǎn)樣，以三氯甲烷—丙酮（10∶0.5

，V/V

）為展開劑，展開至適宜高度，取出，自然晾干，用5%香草醛硫酸溶液噴霧顯色，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光燈下檢視。薄層色譜中，供試品與對(duì)照藥材溶液在相對(duì)應(yīng)位置呈同樣顏色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離良好，而陰性對(duì)照無同樣顏色的干擾斑點(diǎn)。該法操作簡(jiǎn)單，具重現(xiàn)性，可用于方中山藥的鑒別。結(jié)果見圖1D。

2.1.5

黃芩的薄層鑒別 稱取益腎降糖膠囊（批次20181101，20181105，20181108）內(nèi)容物10 g，加乙酸乙酯—甲醇（3：1）20 mL，回流加熱30 min，冷卻，離心，取上清液水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，制成供試品溶液。另取不含黃芩的供試品，同法制備缺黃芩的陰性對(duì)照溶液。再取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 毫升含1 mg 黃芩苷的對(duì)照品溶液。取上述溶液各10 μL，在同一硅膠G 層析板上分別點(diǎn)樣，以乙酸乙酯—丁酮—甲酸—水（5∶3∶1∶1，

V/V/V/V

）為展開劑，展開至適宜高度，取出，自然晾干，用2%三氯化鐵乙醇溶液噴霧顯色，加熱至斑點(diǎn)顏色清晰，在日光燈下觀察。薄層色譜中，供試品與對(duì)照品溶液在相對(duì)應(yīng)的位置呈同樣的暗綠色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離良好，而陰性對(duì)照無同樣顏色的干擾斑點(diǎn)。該法操作簡(jiǎn)單，具重現(xiàn)性，可用于方中黃芩的鑒別。結(jié)果見圖1E。

2.2 含量測(cè)定（避光操作）

2.2.1

色譜參數(shù)的選擇 Ultimate? XB-C色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，30%A，15～20 min，30%～50% A，20～30 min，50% A，30～35 min，50%～30% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置芍藥苷為230 nm，二苯乙烯苷和黃芩苷為320 nm；柱溫40 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，供試品中芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷與其他成分均分離良好，分離度均＞1.5，陰性對(duì)照溶液色譜相應(yīng)位置未顯示相同的吸收峰，理論板數(shù)以芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷峰計(jì)均不低于3 000，結(jié)果見圖2。

圖2 高效液相色譜圖：A為對(duì)照品溶液（λ=230 nm）；B為供試品溶液（λ=230 nm）；C為缺赤芍陰性溶液（λ=230 nm）；D為對(duì)照品溶液（λ=320 nm）；E為供試品溶液（λ=320 nm）；F為缺首烏陰性溶液（λ=320 nm）；G為缺黃芩陰性溶液（λ=320 nm）

2.2.2

對(duì)照品混合溶液的配制 分別取芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別制成每1 毫升含芍藥苷0.391 5 mg、黃芩苷0.451 0 mg、二苯乙烯苷0.246 2 mg的各對(duì)照品貯備液；再精密量取上述芍藥苷貯備液5 mL、黃芩苷貯備液5 mL、二苯乙烯苷貯備液1 mL，置同一25 m L 棕色容量瓶中，加甲醇定容，混合均勻，制成每1 毫升含芍藥 苷78.300 μg、黃 芩 苷90.200 μg，二 苯 乙 烯 苷9.848 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3

供試品溶液的配制 取益腎降糖膠囊2 粒，倒取內(nèi)容物混合均勻，取0.34 g，精密稱定，置于碘量瓶中，精密加入稀乙醇溶液10 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，冷卻，繼續(xù)稱定重量（用稀乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量），搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4

陰性對(duì)照溶液的配制 分別取不含赤芍、制何首烏、黃芩的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下的制備方法分別制成缺赤芍、制何首烏、黃芩的陰性溶液。

2.2.5

線性關(guān)系考察 分別精密吸取適量的二苯乙烯苷、芍藥苷、黃芩苷對(duì)照品貯備液，制成每1 毫升含二苯乙烯苷分別為3.939，4.924，7.878，9.848，14.772 μg，含 芍 藥 苷 分 別 為31.320，78.300，117.450，156.600，234.900 μg，含 黃 芩 苷36.080，90.200，135.300，180.400，270.600 μg 的5 個(gè)系列對(duì)照品混合溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜參數(shù)，上述5個(gè)對(duì)照品混合溶液各精密吸取10 μL，分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，記錄各濃度對(duì)照品混合溶液的峰面積。采用Chromeleon 色譜工作站軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以峰面積（Y^）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（

X

）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，二苯乙烯苷、芍藥苷、黃芩苷的回歸方程分別為

Y

^=0.602 3

X

-0.034 0（

r

=0.999 5），

Y

^= 0.185 2

X

+ 0.542 2（

r

=0.999 1），

Y

^=0.321 0

X

+ 0.875 2（

r

=0.999 5），結(jié)果表明二苯乙烯苷 在3.939 ～14.772 μg/mL，芍 藥 苷 在31.320 ～234.900 μg/mL，黃芩苷在36.080 ～270.600 μg/mL范圍與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6

精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜參數(shù)依次進(jìn)樣6次，記錄對(duì)照品混合溶液的峰面積。結(jié)果，芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷測(cè)得峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.07%，0.92%，0.79%（

n

=6）。

2.2.7

重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批益腎降糖膠囊（批次20181110），按照“2.2.3”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液6 份，再分別精密吸取10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜參數(shù)依次進(jìn)樣分析。結(jié)果，芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.452 0 mg/g，6.210 5 mg/g，0.225 1 mg/g；RSD 分別為0.48 %，0.15%，0.57 %；表明該測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性。再取上述供試品溶液1份，于0，4，8，12，24 h 分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定供試品各成分的峰面積。結(jié)果，供試品中芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯峰面積的RSD 分別為0.76 %，0.80%，0.59 %。說明益腎降糖膠囊供試品溶液中芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷用該方法測(cè)定在24 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.8

加樣回收率試驗(yàn) 取上述重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定的益腎降糖膠囊6份，每份0.17 g，精密稱定，分別置于10 mL 容量瓶中，精密加入芍藥苷對(duì)照品貯備液2 mL、二苯乙烯苷對(duì)照品貯備液0.15 mL，黃芩苷對(duì)照品貯備液2.3 mL，按照供試品溶液制備方法制備加樣回收率試驗(yàn)供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜參數(shù)進(jìn)樣測(cè)定供試品中芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷的含量，并計(jì)算各成分的加樣回收率。芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷、的平均回收率分別為98.96 %，99.91 %，99.89%；RSD 分別為0.76 %，1.16%，1.41%；表明采用該方法測(cè)定益腎降糖膠囊中芍藥苷、黃芩苷、二苯乙烯苷的含量，回收率良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9

樣品的測(cè)量 分別取不同批次的益腎降糖膠囊3 批，按照“2.2.3”的方法制備益腎降糖膠囊供試品溶液3 份，按“2.2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜參數(shù)測(cè)定供試品溶液中芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷的峰面積，并以“2.2.5”項(xiàng)下各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 薄層鑒別藥味的選擇

預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)方中的10味藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別，當(dāng)歸、蒼術(shù)的對(duì)照藥材有熒光斑點(diǎn)，而樣品在相應(yīng)位置無相同的熒光斑點(diǎn)；方中肉蓯蓉的鑒別，供試品與對(duì)照藥材在相同位置有相應(yīng)的斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)不清晰，拖尾明顯；方中太子參的鑒別，按《中國(guó)藥典》一部（2015年版）太子參項(xiàng)下的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果薄層色譜顯示，供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)位置上顯同樣顏色的斑點(diǎn)，但陰性對(duì)照樣品有同樣的干擾斑點(diǎn)；故當(dāng)歸、蒼術(shù)、肉蓯蓉、太子參未納入現(xiàn)質(zhì)控方法中。其他6 味藥的薄層鑒別圖譜斑點(diǎn)清晰可見，分離度良好，專屬性強(qiáng)；其中赤芍與玄參是在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)檢測(cè)，簡(jiǎn)化了步驟，節(jié)約成本。

3.2 提取方法的選擇

含量測(cè)定項(xiàng)目下供試品溶液的制備在提取時(shí)，提取溶劑分別考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇和70%乙醇4種溶劑；提取方法采用超聲提取和水浴加熱回流提取兩種方法，提取時(shí)間考察了15，30，45和60 min，結(jié)果顯示采用稀乙醇超聲提取30 min，測(cè)得各成分含量最高，且該提取方法操作簡(jiǎn)單可行，故最終提取方法采用稀乙醇超聲提取30 min。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

芍藥苷、二苯乙烯苷、黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為230，280，320 nm。230，280 nm處3個(gè)成分均有吸收，320 nm處芍藥苷無吸收；其中二苯乙烯苷在230、280 nm 處的吸收較小，且樣品中二苯乙烯苷含量較低，故選擇其最大吸收波長(zhǎng)320 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)；黃芩苷在320 nm，280 nm 處的吸收均較大，且在兩波長(zhǎng)處測(cè)量結(jié)果基本一致；芍藥苷在230 nm處吸收最強(qiáng)，故最終確定230 nm波長(zhǎng)測(cè)定芍藥苷，320 nm波長(zhǎng)測(cè)定二苯乙烯苷和黃芩苷。

3.4 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的組成及比例對(duì)樣品峰的峰型及出峰時(shí)間都有很大的影響，曾考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等體系，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-0.2%磷酸溶液體系時(shí)，三成分峰型比較對(duì)稱，故選擇作為流動(dòng)相體系。多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇-0.2%磷酸溶液的比例大于40∶60 時(shí)，芍藥苷與二苯乙烯苷出峰時(shí)間接近，兩成分無法完全分開，而流動(dòng)相比例低于40∶60時(shí)，黃芩苷的出峰時(shí)間在60 min 左右，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮各因素，最終確定梯度洗脫，三種成分得到良好的分離，且檢測(cè)時(shí)間控制在40 min 以內(nèi)，提高了效率。

綜上所述，本質(zhì)控方法可操作性強(qiáng)，具有良好的重現(xiàn)性，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高，可用于益腎降糖膠囊的質(zhì)量控制。