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        大黃素上調(diào)微小RNA-206減輕缺氧誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷

        2021-04-09 08:51:34吳坤張建剛孫科朱金釗
        安徽醫(yī)藥 2021年4期
        關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激檢測

        吳坤,張建剛,孫科,朱金釗

        作者單位:安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 安陽455000

        缺氧(hypoxia)可導(dǎo)致機(jī)體器官功能障礙,誘導(dǎo)很多病理過程的發(fā)生,如氧化應(yīng)激、炎癥等。缺氧性腦病是一個(gè)嚴(yán)重的臨床問題,造成許多病人的運(yùn)動障礙、認(rèn)知功能障礙和死亡。從干燥根莖和虎杖根中提取的大黃素(Emodin)具有抗氧化作用和抗腫瘤作用。越來越多的證據(jù)表明,大黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用,可以減少活性氧、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白1的產(chǎn)生來防止動脈粥樣硬化斑塊的形成。但是,大黃素在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用的機(jī)制尚未十分清楚。微小RNA(miRNA)指一組長度為21~25 nt 的非編碼RNA,它通過調(diào)節(jié)特定基因參與多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞增殖、分化和代謝。研究表明,miRNA在多種類型的疾病中異常表達(dá),包括心臟病、炎性疾病和癌癥。微小RNA-206(miR-206)在神經(jīng)損傷病人中的表達(dá)水平出現(xiàn)異常,其是否參與大黃素的作用機(jī)制尚未清晰。于2018年6月至2019年6月,以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為對象,進(jìn)行本研究,旨在探索大黃保護(hù)缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的功能機(jī)制與miR-206的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        PC12細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫;大黃素購自Sigma 公司;二甲基亞砜(DMSO)購自上海鈺博生物科技有限公司;兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體購自碧云天;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Abbkine;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45μm)購自Millipore公司;膜聯(lián)蛋白/異硫氰酸熒光素-碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自Solarbio;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;活性氧(ROS)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒、人白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒購自北京中生北控公司;RNA 試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自TaKaRa公司。

        1.2 方法

        1.2.1

        細(xì)胞的培養(yǎng) 用10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行37 ℃、5%二氧化碳的條件下培養(yǎng)傳代。

        1.2.2

        細(xì)胞的分組與處理 將正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞標(biāo)記為對照(NC)組;參照張開明的方法將氣體調(diào)至1%氧氣、5%二氧化碳、94%氮?dú)膺M(jìn)行缺氧處理,用大鼠神經(jīng)生長因子NGF處理2 h再置于氣體中培養(yǎng),以此法建立缺氧PC12 細(xì)胞,將其標(biāo)記為hypoxia 組。將0.1%DMSO處理的缺氧PC細(xì)胞標(biāo)記為DMSO組。用0.1%的DMSO稀釋大黃素Emodin(2、4、6 μg/mL),然后處理hypoxia組細(xì)胞48 h,分別標(biāo)記為hypoxia+2 μg/mL Emodin組、hypoxia+4 μg/mL Emodin組、hypoxia+6 μg/mL Emodin組,從中篩選最適濃度組hypoxia+4 μg/mL Emodin組,將其標(biāo)記為hypoxia+Emodin組。用脂質(zhì)體法,取4倍量的脂質(zhì)體與DNA混合,將miRNA陰性對照(miR-con)、miR-206、4 μg/mL Emodin+抗-miRcon(anti-miR-con)、4 μg/mL Emodin+抗-miR-206(antimiR-206)轉(zhuǎn)染至hypoxia組細(xì)胞,轉(zhuǎn)染4 h后,更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的效率,將轉(zhuǎn)染成功的組標(biāo)記為hypoxia+miR-con 組、hypoxia+miR-206組、hypoxia+Emodin+anti-miR-con組、hypoxia+Emodin+anti-miR-206組。

        1.2.3

        Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞,用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,然后取500 μL細(xì)胞加入離心管,再取5 μL的Annexin V-/FITC,避光反應(yīng)15 min,結(jié)束后再加入5 μL的PI,避光反應(yīng)10 min,迅速上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.4

        Western blotting 檢測細(xì)胞中Cleaved-caspase-3 的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞,用裂解液裂解后提取總蛋白,并進(jìn)行蛋白定量,再用上樣緩沖液混懸細(xì)胞后進(jìn)行沸水浴變性10 min,取上清進(jìn)行蛋白電泳上樣。電泳結(jié)束后,用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)磨過程要在4 ℃冰箱中完成。結(jié)束后,用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉,然后將膜轉(zhuǎn)移至稀釋好的一抗溶液中,4 ℃冰箱中孵育過夜。取出膜,將其轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中,室溫孵育2 h,洗膜。用ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光,然后用Image J 分析條帶的灰度值,以β-actin 為內(nèi)參,以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

        1.2.5

        ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中MDA、SOD、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量 檢測細(xì)胞上清液中MDA、SOD、ROS、TNF-α、IL-1β的含量。

        1.2.6

        qRT-PCR 法檢測細(xì)胞中miR-206 mRNA 的表達(dá) 收集細(xì)胞,用RNA 抽提試劑盒提取細(xì)胞的總RNA,再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成。用qRT-PCR 試劑盒按照94 ℃變性2 min;然后94 ℃,30 min;58 ℃,30 s;72 ℃,30 s 進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增,后延伸溫度72 ℃,2 min,45 個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行擴(kuò)增,以U6為內(nèi)參,2法計(jì)算miR-206 mRNA 表 達(dá)。miR-206 的正向引物為5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3',反向引物為 5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'。 U6的正向引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向引物為 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

        2 結(jié)果

        2.1 不同濃度Emodin 對缺氧處理的PC12 凋亡的影響

        與NC 組(4.29±0.43)%相比,0.1%DMSO 組細(xì)胞中的凋亡率(4.37±0.44)%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

        P

        >0.05),見圖1。與NC 組相比,hypoxia 組細(xì)胞凋亡率顯著升高,Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著升高,與hypoxia 組相比,hypoxia+2 μg/mL Emodin 組、hypoxia+4 μg/mL Emodin 組、hypoxia+6 μg/mL Emodin組細(xì)胞凋亡率均顯著降低,Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著降低(

        P

        <0.001)。見表1、圖2、圖3。

        表1 不同濃度Emodin對缺氧處理的PC12凋亡的影響(重復(fù)次數(shù)=3,n=9)/±s

        圖3 不同濃度Emodin的條件下Western blotting檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

        2.2 Emodin 對缺氧處理的PC12 氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

        與NC 組相比,hypoxia 組細(xì)胞MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著升高,SOD 的含量顯著降低,與hypoxia 組相比,Hypoxia+Emodin 組細(xì)胞MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著降低,SOD的含量顯著升高(

        P

        <0.001),見表2。

        2.3 Emodin 對miR

        -

        206 表

        達(dá)

        與NC 組(1.00±0.12)相比,hypoxia 組細(xì)胞miR-206 的表達(dá)量(1.00±0.12)顯著降低,與hypoxia 組(0.30±0.03)相比,Hypoxia+Emodin 組 細(xì) 胞miR-206 的 表 達(dá) 量(0.90±0.09)顯著升高(

        P

        <0.001)。

        2.4 高表達(dá)miR

        -

        206對hypoxia處理的PC12凋亡,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

        與NC組相比,hypoxia組細(xì)胞miR-206 的表達(dá)量(顯著降低,Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高,MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量均顯著升高,SOD的含量顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高;與hypoxia+miR-con 組相比,hypoxia+miR-206組細(xì)胞miR-206的表達(dá)量顯著升高,Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)顯著降低,MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量均顯著降低,SOD的含量顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(

        P

        <0.001)。見表3、圖4。

        圖4 高表達(dá)miR-206條件下Western blotting檢測Cleaved-caspase-3表達(dá)

        2.5 低表達(dá)miR

        -

        206可以減輕Emodin 對缺氧處理的PC12 凋亡,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

        與hypoxia 組相比,hypoxia+ Emodin 組細(xì)胞中miR-206 的表達(dá)量顯著升高,Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低,MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著降低,SOD 的含量顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低;與hypoxia+ Emodin 組 相 比,hypoxia+ Emodin+anti-miR-206 組細(xì)胞中miR-206 的表達(dá)量顯著降低,Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)顯著升高,MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著升高,SOD 的含量顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高(

        P

        <0.001)。見圖5、表4。

        圖5 低表達(dá)miR-206條件下Western blotting檢測Cleaved-caspase-3表達(dá)

        3 討論

        表2 Emodin對缺氧處理的PC12中MDA、SOD、ROS活性和TNF-α、IL-1β含量的影響(重復(fù)次數(shù)=3,n=9)/±s

        表3 高表達(dá)miR-206對hypoxia處理的PC12凋亡,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響(重復(fù)次數(shù)=3,n=9)/±s

        表4 低表達(dá)miR-206可以減輕Emodin對缺氧處理的PC12凋亡,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響(重復(fù)次數(shù)=3,n=9)/±s

        大黃素是一種提取自干燥根莖和虎杖根的提取物,可以保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧缺血腦損傷。Guo等發(fā)現(xiàn),在缺血缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞的活力降低,而細(xì)胞中激活素A和caspase-3的表達(dá)增加,大黃素處理后提高了缺氧葡萄糖的神經(jīng)元樣細(xì)胞的存活率,增加了激活素A的表達(dá),并降低了caspase-3的表達(dá),表明大黃素可通過激活素A信號通路抑制神經(jīng)元凋亡并減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。曾歡歡等在研究中發(fā)現(xiàn),大黃素治療后,大鼠的自噬小體融合減輕,脊髓神經(jīng)纖維脫髓鞘明顯減輕,炎性因子TNF-α、IL-6明顯降低,Nrf2-ARE信號通路活性明顯升高,揭示大黃素發(fā)揮神經(jīng)損傷保護(hù)作用的機(jī)制與Nrf2-ARE信號通路的活化程度緊密相關(guān)。本研究建立了NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型,用流式細(xì)胞術(shù)檢測大黃素處理的受損細(xì)胞的凋亡率,發(fā)現(xiàn)大黃素可呈濃度依賴性抑制細(xì)胞的凋亡,并下調(diào)Cleaved-caspase-3表達(dá),進(jìn)一步用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子MDA、SOD、ROS和炎性因子TNF-α、IL-1β的含量,發(fā)現(xiàn)大黃素可下調(diào)細(xì)胞中MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量,上調(diào)SOD的含量,說明大黃素具有明顯的抗氧化應(yīng)激、抗炎作用,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與前人的研究結(jié)果相吻合,再次證實(shí)了大黃素在神經(jīng)損傷疾病中的保護(hù)作用。通過qRTPCR法檢測細(xì)胞中miR-206的表達(dá),發(fā)現(xiàn)大黃素可恢復(fù)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-206的下調(diào),由此推測大黃素在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用機(jī)制可能與miR-206的表達(dá)水平具有相關(guān)性。不足之處在于,這個(gè)結(jié)果未在動物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

        miRNA在神經(jīng)疾病中起著至關(guān)重要的作用。在缺氧缺血性腦損傷(HIBD)引起的海馬神經(jīng)元中,miR-592-5p水平降低。miR-592-5p模擬物給藥通過靶向前列腺素DP受體(PTGDR)來預(yù)防HIBD引起的海馬神經(jīng)元損傷。腦室內(nèi)注射miR-126-3p模擬物通過抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的PIK3R2和Akt信號通路來減輕血腦屏障破壞、腦水腫和神經(jīng)元損傷。Xu等在神經(jīng)性疼痛的研究中通過微陣列分析、qRTPCR法分析miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),miR-206是其中表達(dá)異常降低的5個(gè)miRNA之一,說明血清中miRNA是神經(jīng)性疼痛的潛在預(yù)測因子。Wen等在研究中報(bào)道,miR-206-3p在慢性坐骨神經(jīng)損傷大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中降低,上調(diào)miR-206-3p可以緩解神經(jīng)性疼痛并降低組蛋白脫乙酰基酶4(HDAC4,miR-206-3p 的預(yù)期靶標(biāo))水平,HDAC4的過表達(dá)可減弱miR-206-3p對神經(jīng)性疼痛的作用,顯示,miR-206-3p-HDAC4信號通路在慢性坐骨神經(jīng)損傷誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛中具有潛在的重要作用。Sun等發(fā)現(xiàn),miR-206在慢性收縮性損傷的大鼠背根神經(jīng)節(jié)損傷中的表達(dá)水平異常下調(diào),過表達(dá)miR-206后,大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平降低,以時(shí)間依賴性方式減輕慢性收縮性損傷大鼠的機(jī)械性異常疼痛和熱痛覺過敏,這提示miR-206可能充當(dāng)神經(jīng)性疼痛治療的潛在靶標(biāo)。本研究通過qRT-PCR法檢測了NGF誘導(dǎo)的PC12損傷細(xì)胞中miR-206的表達(dá)發(fā)現(xiàn),其中miR-206異常降低,氧化應(yīng)激水平明顯升高,炎性水平明顯升高,細(xì)胞凋亡率顯著升高,過表達(dá)miR-206后,能夠明顯的減輕NGF誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的上述損傷,這個(gè)結(jié)果揭示了miR-206 對NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡功能,提示miR-206在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中的潛在治療價(jià)值。深入研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-206明顯地減弱大黃素對缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,這更說明大黃素在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用的機(jī)制與上調(diào)miR-206的表達(dá)具有明顯相關(guān)性,兩者具有協(xié)同作用。

        綜上所述,大黃素對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡的作用,其機(jī)制與協(xié)同miR-206相關(guān)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中藥的功能機(jī)制的探索開辟了新道路,也為大黃素在神經(jīng)損傷疾病中的治療價(jià)值研究奠定基礎(chǔ)。

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