劉少靜，騰軍放，許玉明，李玉生，張杰文，馬建軍

作者單位：1安鋼集團(tuán)公司職工總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 安陽(yáng)455000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州450000；3河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州450000

缺血性中風(fēng)又稱作缺血性腦卒中，是最常見(jiàn)的一種腦卒中類(lèi)型，其病理機(jī)制主要是由于顱內(nèi)動(dòng)脈管腔中血栓形成或栓子停留，血管出現(xiàn)狹窄和閉塞，造成相應(yīng)供血區(qū)域血流降低、中斷，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧甚至壞死，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的神經(jīng)缺損癥狀。大腦缺血缺氧會(huì)引起一系列病變，比如神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性壞死、腦水腫、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，并表現(xiàn)出感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能受損的神經(jīng)功能缺損癥狀，重癥者意識(shí)喪失，是病人致殘、致死的主要原因。血腦屏障（BBB）是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）、周細(xì)胞、細(xì)胞外連續(xù)的基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)及神經(jīng)元構(gòu)成神經(jīng)血管單元。BBB選擇性通透結(jié)構(gòu)受多種因素的共同調(diào)節(jié)，細(xì)胞間連續(xù)緊密連接（tight juctions，TJs）是保證BBB選擇性通透的重要結(jié)構(gòu)之一，TJs中最主要的蛋白有胞質(zhì)緊密黏連蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）、緊密連接蛋白（claudin-5），其表達(dá)和分布與BBB的結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)，當(dāng)發(fā)生缺血性中風(fēng)時(shí)TJs表達(dá)明顯減少，TJs 結(jié)構(gòu)松弛，BBB 完整性破壞；基質(zhì)金屬蛋白9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）的激活使得基底膜降解，屏障結(jié)構(gòu)進(jìn)一步遭到損傷，這些蛋白的表達(dá)不僅與缺血性中風(fēng)BBB結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，還參與多種退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

桑黃酮G（kuwanon G，KG）是傳統(tǒng)中藥桑白皮的主要黃酮類(lèi)化合物之一，已有研究表明，KG 可對(duì)抗口腔病原體的活性；Jung等發(fā)現(xiàn)KG 可以抑制卵白蛋白（ovalbumin，OVA）誘發(fā)的哮喘過(guò)敏小鼠模型中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)并減少促炎細(xì)胞因子的分泌；KG 具有中值有效濃度（EC 50）（0.8±0.04）mg/L 和中位致死濃度（LC 50）（38.0±0.82）mg/L，可以安全、有效地控制魚(yú)鱗病。近期有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用人上皮結(jié)腸直腸腺癌（Caco-2）細(xì)胞構(gòu)建體外腸道上皮屏障模型，探索KG 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的上皮屏障的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)KG 能夠抑制炎性因子（IL-1β 和TNF-α）的分泌，抗氧化應(yīng)激作用，上調(diào)細(xì)胞連接蛋白ZO-1、Occludin和細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）的表達(dá)，同時(shí)升高內(nèi)皮電 阻 值（Transendothelial electrical resistance，TEER），對(duì)腸道屏障有明顯的保護(hù)作用。本研究于2018年10月至2019年9月進(jìn)行，運(yùn)用大腦中動(dòng)脈阻塞模型探討桑黃酮G對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠腦水腫及BBB 的影響，探索作用機(jī)制，為桑黃酮G 治療缺血性中風(fēng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45 只成年雄性健康的SD 大鼠，體質(zhì)量范圍250～300 g，購(gòu)自昆明國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（云）2018-0033。飼養(yǎng)室溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，自由進(jìn)食和飲水，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在相同條件下飼養(yǎng)，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 試劑和儀器

桑黃酮G 購(gòu)自北京百靈威科技公司。zo-1 兔抗（Thermo）、VE-cadherin 兔抗（Abcam）、Occludin 兔抗（Abcam）、Claudin-5 兔抗（Abcam）、MMP-9 兔抗（Abcam）、β-actin 兔抗（Abcam）、Western Blot 一抗和二抗稀釋液（碧云天）、羊抗鼠DyLinght800熒光二抗（Thermo）、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（碧云天）、RIPA蛋白提取試劑盒（碧云天）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（碧云天）、5×SDS 蛋白上樣緩沖液（碧云天）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天）、30%丙烯酰胺（Bio-Rad）、APS（Acros）、1.5M Tri-HCL（pH 6.8、8.8，上海雙螺旋）、蛋白分子量marker（Bio-Rad）、BSA（USA）、PVDF 膜（Bio-Rad）、MCAo 栓線（A4 級(jí)，北京西農(nóng)科技有限公司）、SDS-PAGE 凝膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad）、雙信道紅外線激光成像系統(tǒng)（Odyssey，Li-COR）。

1.3 動(dòng)物分組與處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將45 只SD 成年雄性大鼠分為假手術(shù)組、模型組（MCAo）和治療組（KG），每組15 只。其中假手術(shù)組大鼠按模型分離血管后縫合，模型組和治療組大鼠建立大腦中動(dòng)脈阻塞模型，治療組大鼠在手術(shù)前每日1 次定時(shí)灌服5 mg/kg的KG 預(yù)處理，連續(xù)灌服3 d，假手術(shù)組和模型組大鼠給予同體積的無(wú)菌水。術(shù)前禁食禁水8 h，術(shù)后繼續(xù)按術(shù)前灌服7 d后取材。

1.4 MCAo 模型的制備

根據(jù)Longa 等改良后的線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈模型制備本研究MCAo模型。剔除大鼠頸部皮膚備皮，75%的酒精棉球消毒備皮區(qū)域皮膚，用眼科剪于頸部正中間的位置做長(zhǎng)約0.5 cm左右縱向切口，逐層剪開(kāi)，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA），分離開(kāi)與血管相并行的神經(jīng)及筋膜，并掛線備用。結(jié)扎CCA和ECA近心端，顯微剪在CCA近血管分叉口處剪一小缺口，將栓線由缺口處向ECA方向緩慢插入大腦中動(dòng)脈（MCA）起始段，栓線標(biāo)記長(zhǎng)度到達(dá)CCA 與ICA、ECA分叉處時(shí)結(jié)扎ECA并固定栓線，清理切口處，逐層縫合。術(shù)后采用置于安靜空間單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

各組大鼠術(shù)后6 h、1 d、3 d、7 d 分別采用改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（modified Neurological Severity Scores，mNSS）神經(jīng)功能評(píng)分法評(píng)估神經(jīng)功能缺損，總分為18 分，分?jǐn)?shù)越高神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，0～7分均認(rèn)為無(wú)缺損癥狀。

1.6 腦含水量測(cè)定

術(shù)后1 d、2 d、3 d、7 d，每組分別取3 只實(shí)驗(yàn)大鼠，予以1%戊巴比妥鈉（4 mL/kg）腹腔麻醉，迅速分離取出大鼠全腦，稱量全腦組織濕重，隨后放入烘箱100 ℃，48 h 后稱量腦組織重量，即為干重，計(jì)算大腦含水量：含水量（%）=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）檢測(cè)大鼠腦組織中BBB相關(guān)蛋白的表達(dá)

每組分別選取3只大鼠，使用1%戊巴比妥鈉（4 mL/kg）腹腔麻醉，開(kāi)胸充分暴露胸腔及心臟，將灌注針插入左心房并固定針頭，剪開(kāi)右心耳，緩慢推注預(yù)冷的生理鹽水200 mL；小心剖開(kāi)顱骨取出大腦，分離梗死側(cè)大腦組織，移入制冷的EP管中，剪成組織碎片，稱重，按（100 mg 組織樣品）/（200 μL 含0.01 mol/L PMSF的RIPA裂解液）比列進(jìn)行，利用勻漿機(jī)裂解樣品，冰上操作，12 000 r/min，4 ℃15 min，收集離心所后得的將上清液即為所提取的總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)進(jìn)行定量計(jì)算后稀釋樣品，加上樣緩沖液，煮沸10 min。每個(gè)樣品取30 μg蛋白上樣，同時(shí)在兩邊孔分別加入5 μL、2 μL Marker進(jìn)行電泳，結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據(jù)分子量大小及Marker的位置切膜，分別加入MMP-9單克隆抗體（1∶1 000）、ZO-1單克隆抗體（1∶1 000）、Claudin-5單克隆抗體（1∶1 000）、Occludin 單克隆抗體（1∶5 000）和β-actin單克隆抗體（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜每5分鐘3次，避光加入羊抗鼠DyLinght800熒光二抗（1∶5 000），室溫避光孵育2 h，TBST 洗膜每5 分鐘3 次，使用Odyssey進(jìn)行暗室發(fā)光得到條帶，使用Image J進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 KG 能顯著改善缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能缺損

MCAo 模型制備后6 h、1 d、3 d、7 d，分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分檢測(cè)。mNSS 評(píng)分（

F

=22.37，

P

＜0.001）、時(shí)間（

F

=28.31，

P

＜0.001）及二者共同（

F

=15.73，

P

＜0.001）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)相比，模型組大鼠結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高，出現(xiàn)缺損表現(xiàn)，主要有感覺(jué)功能障礙、平衡能力下降、偏癱甚至無(wú)自主運(yùn)動(dòng)等中風(fēng)表現(xiàn)。但是經(jīng)過(guò)KG 治療后，1 d 能明顯改善缺損（

P

＜0.01），3 d、7 d改善更為明顯（

P

＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)/±s

2.2 KG能明顯減輕缺血性中風(fēng)大鼠腦水腫

分別測(cè)量各組大鼠術(shù)后1 d、2 d、3 d、7 d，腦含水量（

F

=3.079，

P

＜0.05）、時(shí)間（

F

=143.6，

P

＜0.001）及二者共同（

F

=1.847，

P

＞0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦含水量增加（

P

＜0.001），且于2 d時(shí)腦水腫最為明顯；而經(jīng)KG治療后，大腦含水量明顯下降（

P

＜0.001），說(shuō)明KG可以顯著緩解缺血性中風(fēng)大鼠腦水腫。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦含水量統(tǒng)計(jì)/±s

2.3 KG 能顯著上調(diào)ZO

-

1、Occludin 和Claudin

-

5的表達(dá)及下調(diào)MMP

-

9 的表達(dá)

造模后7 d 如方法所述運(yùn)用Western blotting 檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 和Claudin-5 及基質(zhì)金屬蛋白MMP-9 的表達(dá)。如圖1 及表3 所示，與假手術(shù)組相比，模型組緊密連接蛋白的表達(dá)明顯減少（

P

＜0.001），MMP-9 表達(dá)顯著升高（

P

＜0.001），而予以KG 治療后，緊密連接蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（

P

＜0.001），MMP-9 的表達(dá)顯著下調(diào)（

P

＜0.001）。結(jié)果表明KG 可通過(guò)上調(diào)ZO-1、Occludin 和Claudin-5 的表達(dá)，下調(diào)MMP-9 的表達(dá)減少基底膜的損傷，從而保護(hù)BBB完整性。

圖1 各組大鼠緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5及基質(zhì)金屬蛋白MMP-9的表達(dá)

3 討論

桑白皮作為傳統(tǒng)常用中藥材，具有瀉肺平喘，行水消腫的功效，具有抗氧化應(yīng)激、降血糖、抗癌、抗炎、保護(hù)腸屏障等作用。臨床上常用于治療水腫、咳嗽、糖尿病、氣管炎等疾病。然而對(duì)于缺血性中風(fēng)的治療尚不明確，但研究已經(jīng)表明對(duì)于腸道屏障完整性有一定的保護(hù)作用，那么設(shè)想可能對(duì)BBB也具有一定的保護(hù)作用，對(duì)腦水腫可能有調(diào)節(jié)作用。

BBB 是存在于血液循環(huán)與大腦內(nèi)環(huán)境之間的嚴(yán)格的、動(dòng)態(tài)的、選擇性的物理屏障，通常血液中的小分子物質(zhì)（如：水、氧氣、葡萄糖、二氧化碳、氨基酸等）及有益物質(zhì)能正常透過(guò)BBB，而大分子物質(zhì)及有害物質(zhì)（如外來(lái)藥物、氫離子、膽鹽及非脂溶性物質(zhì)）幾乎不會(huì)通過(guò)BBB。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及退行性疾病，如中風(fēng)、腦外傷、阿爾海默茲病、帕金森等均會(huì)導(dǎo)致BBB的完整性破壞，引發(fā)生腦水腫、炎癥等，神經(jīng)系統(tǒng)失去保護(hù)屏障，引發(fā)一系列的神經(jīng)功能缺損癥狀。在本研究中，我們運(yùn)用大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，給予KG治療。結(jié)果顯示，MCAo大鼠神經(jīng)功能明顯缺損，而予以KG治療后神經(jīng)功能缺損狀況明顯得到改善；MCAo大鼠腦含水量增加，且術(shù)后2 d腦水腫最為嚴(yán)重，說(shuō)明MCAo大鼠的確存在著腦水腫；而給予KG治療后，MCAo大鼠大腦含水量顯著下降，由此可見(jiàn)，KG可顯著減輕腦水腫。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間廣泛的TJs作為維持BBB的完整性的主要結(jié)構(gòu)，其緊密狀態(tài)及TJs蛋白的表達(dá)與BBB密切相關(guān)，ZO-1、occludin 和claudin-5是構(gòu)成TJs 的重要分子蛋白，同時(shí)BBB結(jié)構(gòu)的維持還有賴于基底膜的完整性，MMP-9表達(dá)減少有助于維持基底膜結(jié)構(gòu)，這些分子的表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致TJs松弛及BBB的結(jié)構(gòu)改變，缺血缺氧等變化常會(huì)導(dǎo)致ZO-1、Occludin 和Claudin-5的表達(dá)下降，這些分子的異常表達(dá)會(huì)嚴(yán)重破壞TJs結(jié)構(gòu)，MMP-9的表達(dá)升高使基底膜的穩(wěn)定破壞，會(huì)進(jìn)一步加重BBB的損傷。而升高維持這些分子正常表達(dá)，能夠有效保護(hù)BBB，避免有害物質(zhì)透過(guò)BBB進(jìn)入大腦組織，損傷腦組織及大腦微環(huán)境。在本研究中，我們檢測(cè)到在MCAo模型大鼠腦組織中ZO-1、Occludin 和Claudin-5表達(dá)明顯下調(diào)，MMP-9表達(dá)明顯升高。而經(jīng)過(guò)KG治療的MCAo大鼠，腦組織中ZO-1、Occludin 和Claudin-5表達(dá)明顯上調(diào)，MMP-9表達(dá)明顯抑制，這就提示KG能夠顯著上調(diào)Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達(dá)水平，維持BBB 緊密連接，同時(shí)抑制MMP-9表達(dá)，減少基底膜的降解，進(jìn)一步維持BBB結(jié)構(gòu)的完整性。

表3 各組大鼠緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5及基質(zhì)金屬蛋白MMP-9的表達(dá)/±s

總之，我們的研究結(jié)果表明MCAo 模型大鼠神經(jīng)功能明顯損傷、腦水腫嚴(yán)重，其機(jī)制可能與緊密連接松弛，基底膜損傷，BBB完整性破壞有關(guān)；KG治療后明顯恢復(fù)了大鼠的神經(jīng)功能，KG 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)提高緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表達(dá)，同時(shí)抑制MMP-9 激活，恢復(fù)緊密連接狀態(tài)及基底膜結(jié)構(gòu)，維持BBB 完整性有關(guān)。我們的研究初步解釋了KG 腦保護(hù)的機(jī)制是通過(guò)對(duì)BBB 完整性的保護(hù)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)于KG 其他的腦保護(hù)分子機(jī)制進(jìn)一步深入研究，將有利于更好的開(kāi)發(fā)和利用KG這一傳統(tǒng)中藥活性成分。