李 霂，潘夢(mèng)璐，鄭美娟，帥宗文

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA associate vasculitis, AAV)臨床常分為顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangitis, MPA)、嗜酸性肉芽腫性多血管炎(eosinophilic granulomatous polyangiitis, EGPA)和肉芽腫性多血管炎(granulomatous polyangiitis, GPA)，MPA和EGPA中ANCA識(shí)別的主要自身抗原為髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)，GPA中ANCA主要識(shí)別蛋白酶-3(protease 3, PR3)，分別稱為MPO-ANCA和PR3-ANCA。在中國(guó)，AAV主要以MPO-ANCA陽(yáng)性的MPA最為多見，中老年人群高發(fā)，病程進(jìn)展快，病死率高。MPO-AAV的確切發(fā)病機(jī)制未明，研究表明，MPO-ANCA是致病自身抗體。B細(xì)胞發(fā)育成熟為分泌自身抗體(MPO-ANCA)漿細(xì)胞的過(guò)程中，必需CD4的濾泡輔助T細(xì)胞(follicular helper T cells, Tfh)協(xié)助，Tfh表達(dá)有CXC趨化因子受體5(CXC-chemokine receptor 5，CXCR5)和可誘導(dǎo)的共刺激因子(inducible co-stimulator，ICOS)，分別是Tfh的標(biāo)志分子和處于活化狀態(tài)的標(biāo)志，前期研究顯示，MPO-AAV患者周圍血MPO-ANCA水平與CD4T細(xì)胞中Tfh%及其活性程度呈正相關(guān)。

中性粒細(xì)胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是由激活的中性粒細(xì)胞釋放的一種由去致密DNA和蛋白(其中包括MPO和PR3)構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，基本功能之一是胞外捕獲并殺滅病原體。進(jìn)一步研究表明NET有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用，與多種自身免疫病的發(fā)病有關(guān)。已有的研究表明，含有MPO的NET可能參與MPO-AAV的發(fā)病。然而，NET是固有免疫參與者，MPO-ANCA是適應(yīng)性免疫的產(chǎn)物，NET如何干預(yù)MPO-ANCA產(chǎn)生，目前尚未見臨床研究報(bào)道。該研究初步探索NET影響MPO-ANCA的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

35例MPO-AAV患者選自2018年3月—2019年10月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的患者，均符合 2012 年 Chapel Hill 共識(shí)會(huì)議和1990年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院關(guān)于 MPA、GPA 或EGPA 的定義和分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。間接免疫熒光法(IIF)檢測(cè)核周型ANCA(p-ANCA)陽(yáng)性，免疫斑點(diǎn)法和ELISA法檢測(cè)MPO-ANCA均陽(yáng)性。除外抗蛋白酶3抗體(PR3-ANCA)和抗核抗體(anti-nuclearantibody，ANA)陽(yáng)性者，以免其對(duì)研究觀察指標(biāo)的影響。所有患者均為初次確診，病情處于活動(dòng)期，未曾接受過(guò)激素及免疫抑制劑治療。采用修訂的伯明翰血管炎活動(dòng)度評(píng)分(BVAS-V3)評(píng)估每例患者的病情活動(dòng)度。35例健康對(duì)照者隨機(jī)選自該院健康體檢中心，年齡和性別與入組病例匹配，排除結(jié)締組織病史及近期感染性疾病史。研究符合安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的關(guān)于人體試驗(yàn)的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(批文號(hào)：PJ 2014-07-10)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

淋巴細(xì)胞分離液(北京Solarbio公司)；FITC標(biāo)記小鼠抗人CD278抗體(美國(guó)eBioscience公司)；PerCP-CyTM5.5標(biāo)記小鼠抗人CD4抗體、APC標(biāo)記小鼠抗人CD185抗體、PE標(biāo)記小鼠抗人CD279抗體、PE-IgG1-к、APC- IgG2b-к(美國(guó)BD公司)；FITC-IgG1-к(美國(guó)eBioscience公司)；歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷試劑盒、人MPO抗原(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；羊抗人IgG(美國(guó)Sigma公司)；IL-23檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BioTSZ公司)；低速離心機(jī)(Centrifuge5810R，德國(guó)Eppendorf公司)；酶標(biāo)儀(PRA ELX800，美國(guó)萊姆德公司)；流式細(xì)胞儀(FACS Calibur型，美國(guó)BD公司)。

1.3 研究方法

1.3.1

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)外周血Tfh 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的制備：取1 ml抗凝血與1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積混勻稀釋；取1 ml淋巴細(xì)胞分離液于15 ml離心管內(nèi)，將制備的混合液輕注入淋巴細(xì)胞分離液表面；1 260 r/min離心20 min后分為4層(從上至下依次為血漿層、PBMCs層、淋巴細(xì)胞分離液層及紅細(xì)胞層)，取PBMCs層，加入3 ml PBS充分混勻，1 500 r/min離心5 min×3次，加入300 μl PBS 重懸?？贵w標(biāo)記及檢測(cè)：取PBMCs懸液100 μl于流式管中，加入CD4-PerCP-CyTM5.5、CD185-APC、CD278-FITC和CD279-PE各5 μl，每管均設(shè)置同型對(duì)照(加入細(xì)胞懸液100 μl及FITC-IgG1-κ、PE-IgG1-κ和APC-IgG2b-κ各5 μl，振蕩后避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min離心棄上清液，加入300 μl PBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3

IL-23檢測(cè) 采用IL-23檢測(cè)試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書常規(guī)ELISA步驟定量檢測(cè)IL-23。

2 結(jié)果

2.1 入組患者及研究對(duì)照的臨床資料

研究中入選的35例患者病程為0.5～24(5.2±6.1)月，均為初診未治療的患者，BVAS評(píng)分為5～47(19.2±7.3)分，病情均處于活動(dòng)期。病例組與對(duì)照組間年齡分別為23～85(66.0±12.2)歲和28～78(63.5±11.9)歲，男 ∶女分別為16 ∶19和17 ∶18，組間年齡和性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為

t

=0.862，

P

=0.392；χ=0.057，

P

=0.811)?；颊呓M中33例臨床診斷符合MPA，2例符合GPA，患者的人口學(xué)特點(diǎn)及AAV疾病構(gòu)成符合中國(guó)MPO-AAV的特點(diǎn)。

2.2 研究指標(biāo)的組間比較

FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，入組患者CD4T細(xì)胞中Tfh分?jǐn)?shù)(Tfh%)、ICOSTfh占CD4T細(xì)胞分?jǐn)?shù)(ICOSTfh%)及ICOS的平均熒光表達(dá)強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)均高于對(duì)照組。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示病例組周圍血NET及IL-23表達(dá)水平高于對(duì)照組。見表1。

表1 病例組與對(duì)照組各觀察指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 病例組中各觀察指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3.1

MPO-ANCA與Tfh指標(biāo)的相關(guān)性分析 雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，患者周圍血MPO-ANCA水平分別與Tfh%及Tfh表達(dá)ICOS的MFI(表示Tfh的活動(dòng)強(qiáng)度)呈正相關(guān)，但多元線性回歸分析結(jié)果顯示MPO-ANCA水平僅與Tfh%呈正相關(guān)。見表2。分析Tfh%與患者主要內(nèi)臟損害(腎和肺)間的關(guān)系，顯示Tfh%與腎和肺損害BVAS間無(wú)相關(guān)性(分別為

r

=0.306，

P

=0.074；

r

=0.292，

P

=0.089)。

表2 周圍血MPO-ANCA與Tfh指標(biāo)相關(guān)分析結(jié)果(n=35)

2.3.2

周圍血IL-23與觀察指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果 雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，MPO-AAV患者周圍血IL-23水平分別與Tfh%、Tfh活動(dòng)強(qiáng)度及NET呈正相關(guān)。見表3。

表3 周圍血IL-23與研究觀察指標(biāo)的相關(guān)性分析(n=35)

2.3.3

CD4T中Tfh%與IL-23、NET的相關(guān)性分析結(jié)果 雙變量分析結(jié)果顯示Tfh%分別與NET和IL-23呈正相關(guān)，但多元線性回歸分析結(jié)果提示Tfh%僅與NET呈正相關(guān)。見表4。分析NET與患者主要內(nèi)臟損害(腎和肺)間的關(guān)系，顯示NET與腎損害BVAS間存在相關(guān)性(

r

=0.390，

P

=0.021)，與肺損害間無(wú)相關(guān)性(分別為

r

=0.038，

P

=0.827)。

表4 周圍血CD4+ T中Tfh%與NET及IL-23的相關(guān)分析結(jié)果(n=35)

3 討論

淋巴組織中Tfh輔助B細(xì)胞發(fā)育成熟為分泌抗體(包括自身抗體MPO-ANCA)漿細(xì)胞的途徑中，不僅可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10和IL-21等)，還可以通過(guò)表達(dá)ICOS發(fā)揮作用。ICOS是CD28共刺激分子家族的成員，僅表達(dá)于活化的T細(xì)胞，其配體BTRP-1結(jié)構(gòu)性表達(dá)于B細(xì)胞，阻斷ICOS與BTRP-1的相互作用，可以抑制Tfh細(xì)胞的生成和B細(xì)胞的分化，因此，該研究選擇ICOS作為Tfh活性的指標(biāo)。

NET由DNA、組蛋白、MPO、PR3、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)、溶酶體膜蛋白2(lysome-associated membrane protein-2, LAMP-2)等組成。髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells, mDC)屬于專職抗原遞呈細(xì)胞，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，NET可能更易于被淋巴濾泡內(nèi)的mDC捕獲，通過(guò)向Th細(xì)胞更有效地提呈組成NET的自身抗原物質(zhì)，促進(jìn)自體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體ANCA。IL-23是mDC活化過(guò)程產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子之一，具有廣泛的固有免疫和適應(yīng)性免疫的促進(jìn)作用，也是Tfh分化和功能作用不可或缺的細(xì)胞因子。

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，患者組周圍血Tfh%、ICOSTfh%及Tfh的活動(dòng)強(qiáng)度均增高，這與之前的研究結(jié)果一致。病例組中進(jìn)一步分析Tfh各指標(biāo)對(duì)致病抗體MPO-ANCA的可能影響，顯示自身抗體MPO-ANCA僅分別與Tfh%及Tfh的活動(dòng)強(qiáng)度呈正相關(guān)，但多元回歸分析提示僅Tfh%是影響致病抗體MPO-ANCA的獨(dú)立因素。不過(guò)，MPO-AAV患者的臨床損害不僅受MPO-ANCA的影響，同時(shí)受補(bǔ)體旁路激活產(chǎn)生C5a、周圍血中對(duì)抗MPO銅藍(lán)蛋白濃度等因素影響，這可能是該研究中Tfh%與主要內(nèi)臟(腎和肺)損害無(wú)相關(guān)性的原因。目前認(rèn)為，NET可能是參與AAV發(fā)病的重要因素之一，研究表明患者組周圍血中NET水平高于對(duì)照組，且NET與患者常見內(nèi)臟損害腎損害呈正相關(guān)，支持NET可能是參與AAV發(fā)病的重要因素之一。因入組該研究的主要為高齡的MPA患者，影響肺損害評(píng)估的其他因素(如慢性支氣管肺病變伴感染等)可能干預(yù)肺損害BVAS評(píng)估，出現(xiàn)NET與肺損害間無(wú)相關(guān)性。結(jié)果顯示MPO-AAV患者周圍血IL-23高于對(duì)照組，推測(cè)MPO-AAV患者分泌IL-23的mDC的活性增強(qiáng)。病例組中進(jìn)一步分析IL-23與該研究主要觀察指標(biāo)間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL-23與Tfh%、Tfh活動(dòng)強(qiáng)度、NET分別呈正相關(guān)，符合IL-23具有促進(jìn)固有免疫(NET)和適應(yīng)免疫(Tfh細(xì)胞)的廣泛生物學(xué)功能特點(diǎn)。

綜上所述，Tfh%是影響致病自身抗體MPO-ANCA的獨(dú)立影響因素，Tfh%分別與NET及IL-23呈正相關(guān)，經(jīng)多元回歸分析，結(jié)果顯示僅NET是影響Tfh%的獨(dú)立因素。因此，固有免疫NET參與MPO-AAV發(fā)病的可能途徑之一是通過(guò)激活mDC，促進(jìn)適應(yīng)性免疫Tfh%升高以輔助B細(xì)胞發(fā)育成熟，產(chǎn)生特異性自身抗體MPO-ANCA，可能最終導(dǎo)致MPO-AAV發(fā)病。