祝亞蘭，夏曉瓊，王 亮，陶志國，代 鎮(zhèn)，李美鳳

術(shù)后認知功能障礙(perioperative cognitive dysfunction,POCD)是術(shù)前無精神異常的患者受圍術(shù)期各種因素的影響，術(shù)后出現(xiàn)認知、學習、記憶、定向和精神運動行為等方面的障礙。而圍術(shù)期神經(jīng)認知障礙(perioperative neurocognitive disorders,PND)是Evered et al提出的一個新專業(yè)名詞，是由原來的術(shù)后認知功能障礙更名而來。目前，PND的發(fā)病機制尚不清楚。大部分學者認為，術(shù)后認知功能障礙是在老年患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化的基礎上，由手術(shù)和麻醉誘發(fā)，多種因素聯(lián)合作用所致的神經(jīng)功能減退。麻醉藥物如七氟烷、異氟烷可降低自身腦功能代償功能，導致機體缺血性代謝和病理變化，與術(shù)后認知功能障礙關(guān)系密切。

過去認為，老年患者PND的發(fā)生與腦神經(jīng)元的病變密切相關(guān)，而與腦星型膠質(zhì)細胞的關(guān)系不大。隨著研究的深入，星型膠質(zhì)細胞對PND發(fā)生發(fā)展的影響受到越來越多的關(guān)注。有研究表明全身麻醉及手術(shù)創(chuàng)傷可引起炎癥反應，導致星型膠質(zhì)細胞被激活，合成和分泌大量炎性因子，后者可誘導神經(jīng)元發(fā)生凋亡，并最終參與認知功能障礙的發(fā)生。但關(guān)于七氟烷和剖腹探查術(shù)對老年大鼠認知功能障礙關(guān)于星型膠質(zhì)細胞數(shù)量的研究鮮有報道，該研究是建立在剖腹探查術(shù)的動物模型基礎上，探討七氟烷全身麻醉手術(shù)后老年大鼠術(shù)后認知功能障礙與星型膠質(zhì)細胞數(shù)量的關(guān)系，為臨床預防以七氟烷全身麻醉類藥物和剖腹探查術(shù)患者認知功能障礙的發(fā)生提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

七氟烷(20030431，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)，GFAP(MAB360，美國Millipore公司)，通用型二抗試劑盒(PV-6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，離心機(JW3021HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司)，酶標儀(RT-6000，深圳雷杜生命科學有限公司)，麻醉氣體監(jiān)護儀(Infinity Kappa，德國Drager公司)。

1.2 實驗動物

老年SD大鼠，普通級，16月齡，體質(zhì)量400～500 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，所有實驗大鼠置于通風的動物室內(nèi)，保持(22.0±0.5)℃，正常飲水，維持正常的晝夜節(jié)律。

1.3 麻醉方法及分組

30只大鼠隨機分為3組(

n

=10)：對照組、麻醉組、麻醉手術(shù)組。麻醉過程中維持氧流量2 L/min，大鼠置于透明玻璃箱中麻醉，在箱底鋪石灰鈉吸收密閉環(huán)路中的CO，監(jiān)測七氟烷和呼氣末CO濃度，順次連接氧氣、揮發(fā)罐、麻醉氣體監(jiān)護儀，對照組不做任何處理；麻醉組吸入4%七氟烷誘導，待翻正反射消失后吸入2%七氟烷持續(xù)2 h；手術(shù)組吸入4%七氟烷誘導，待翻正反射消失后吸入2%七氟烷持續(xù)2 h，同時行剖腹探查術(shù)。B、C組在翻正反射消失后迅速用16 G套管針對大鼠進行氣管插管，插管成功后將大鼠固定在動物立體定位儀上，對大鼠進行機控呼吸。麻醉手術(shù)結(jié)束后，使大鼠吸入空氣自然蘇醒，待其可自由活動后，放回籠中，在蘇醒后1 d開始進行Morris水迷宮實驗。

1.4 認知功能的測試

該實驗采用Morris水迷宮實驗測定大鼠的空間記憶和學習記憶能力，進而分析大鼠的認知功能。實驗分為兩個部分：定向航行實驗和空間搜索實驗。定向航行實驗是測量大鼠獲取學習記憶的能力。實驗前1周將大鼠放入池中訓練，每次訓練時，先將大鼠放在平臺10 s，讓其熟悉周邊環(huán)境，然后將其頭朝池壁放入水中任一象限，如果在60 s內(nèi)未找到平臺，則引導它找到平臺，在平臺待10 s。每只大鼠每天訓練4次，每次訓練間隔10～20 min，連續(xù)訓練5 d。大鼠完成定向航行訓練后，對不同組別大鼠進行相應處理干預?？臻g搜索實驗用于測量學會尋找平臺后，保持對平臺空間位置記憶的能力。該實驗選取大鼠在定位航行術(shù)后1、3、5 d的逃避潛伏期作為學習能力監(jiān)測指標，并在空間搜索中的術(shù)后第6 天穿環(huán)次數(shù)作為空間記憶能力監(jiān)測指標。

1.5 老年大鼠剖腹探查術(shù)

大鼠先用4%七氟烷麻醉誘導，根據(jù)大鼠對疼痛的反應及時追加麻醉劑量，待翻正反射消失后以2%七氟烷維持，迅速用16 G套管針對大鼠進行氣管插管，插管成功后將大鼠固定在動物立體定位儀上，對大鼠進行機控呼吸。將其腹部皮膚剪去毛發(fā)，消毒后取腹正中切口約4 cm。逐步切開皮膚、皮下組織和腹膜，打開腹腔，依次探查腸道、肝、脾、腎等臟器。

1.6 ELISA檢測血清GFAP濃度

所有大鼠在處死前用非抗凝真空管取尾靜脈血2 ml。獲取血樣后迅速分離分裝血清，在-20 ℃條件下冰凍儲存待檢。血清GFAP濃度采用ELISA法，用美國Millipore公司生產(chǎn)的GFAP試劑盒及配套試劑進行檢測，記錄GFAP濃度。

1.7 腦組織切片制備、免疫組化、掃描分析

術(shù)后第6天水迷宮結(jié)束后斷頭取腦。依次進行腹腔注射、0.9% NaCl溶液沖洗、多聚甲醛固定、脫水。完成后去除腦組織用OCT液常規(guī)包埋、冰凍切片。將腦組織蠟塊放入切片機，行連續(xù)冠狀石蠟切片，片厚5 μm，每隔5張切片取1張，切下的薄片放入溫水浴箱中待燙平后貼到載玻片。切片常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)100%、95%、80%乙醇脫水，放入自來水充分沖洗，直到切片干凈透明。在切片沖洗的時候盛雙蒸水2 L，倒入40 ml、pH8.0 EDTA修復液，電磁爐加熱至沸騰，再將切片連同染色體架放入修復液中，蓋上鍋蓋，沸騰后修復約2 min后停止，將切片連同高壓鍋自然冷卻，不能驟冷。將孵育盒稍裝一點水，將切片一張張拿出，用免疫組化筆圈住組織，放在孵育盒上，在組織上滴加3% HO室溫孵育20 min，PBS沖洗3次/5 min。滴加一抗(GFAP-1 ∶500)，蓋上孵育盒蓋子，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次/5 min。甩干，加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間(有陽性終止顯色)；自來水沖洗后，蘇木精復染，水洗；1%鹽水乙醇分化數(shù)秒，水洗；碳酸鋰藍化1min，水洗；脫水、透明、封片。每只大鼠選取海馬CA1區(qū)切片5張作為觀察對象，再隨機選取一個視野，在顯微鏡下觀察棕色為陽性表達的位置，即記錄星型膠質(zhì)細胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

2.1.1

術(shù)前水迷宮實驗逃避潛伏期結(jié)果 重復測量分析結(jié)果顯示，逃避潛伏期隨著訓練時間增加而縮短(

F

=4 484.25,

P

<0.05)，但3組間逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 術(shù)前3組各時間點逃避潛伏期的比較

2.1.2

術(shù)后水迷宮實驗逃避潛伏期結(jié)果 重復測量分析結(jié)果顯示，3組間逃避潛伏期有統(tǒng)計學差異(

F

=983.12，

P

<0.05)。組內(nèi)比較，術(shù)后第3、5天，各組的逃避潛伏期無統(tǒng)計學意義，術(shù)后第3、5天與術(shù)后1 d逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)；兩兩比較分析顯示，麻醉手術(shù)組逃避潛伏期高于麻醉組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，而麻醉組逃避潛伏期高于對照組(

P

<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠術(shù)后各時間點逃避潛伏期(s)的比較與對照組比較：*P<0.05；與麻醉組比較：#P<0.05

2.2 穿環(huán)次數(shù)的比較和星型膠質(zhì)細胞數(shù)量的比較

術(shù)后第6天穿環(huán)次數(shù)3組間差異有統(tǒng)計學意義(

F

=82.05,

P

<0.05)，組間比較，麻醉手術(shù)組低于對照組和麻醉組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05),麻醉組低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)；海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量3組間差異有統(tǒng)計學意義(

F

=1 089.33,

P

<0.05),組間比較，麻醉手術(shù)組低于對照組和麻醉組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05),麻醉組低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見圖3和表1。

圖3 穿環(huán)次數(shù)和星型膠質(zhì)細胞數(shù)量的比較A：3組間大鼠空間搜索實驗穿環(huán)次數(shù)的比較；B：3組間海馬區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量比較；C：海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞表達(免疫組化×400)；與對照組比較：*P<0.05；與麻醉組比較：#P<0.05

表1 大鼠空間搜索實驗穿環(huán)次數(shù)與海馬區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量比較

2.3 處死前血清GFAP濃度比較

處死前血清GFAP濃度3組間差異有統(tǒng)計學意義(

F

=195.66,

P

<0.05)，組間比較，麻醉手術(shù)組GFAP濃度低于麻醉組和手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)；而麻醉組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 大鼠血清GFAP濃度比較

2.4 空間學習記憶能力與星型膠質(zhì)細胞數(shù)量及血清GFAP濃度的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析表明，麻醉手術(shù)組和麻醉組海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量與術(shù)后1 d逃避潛伏期呈負相關(guān)(

r

=-0.821，

P

<0.05；

r

=-0.969，

P

<0.001)，與穿環(huán)次數(shù)呈正相關(guān)(

r

=0.919，

P

<0.001；

r

=0.896，

P

<0.001)；麻醉手術(shù)組和麻醉組血清GFAP濃度與術(shù)后1 d逃避潛伏期呈正相關(guān)(

r

=0.939，

P

<0.001；

r

=0.933，

P

<0.001)，與穿環(huán)次數(shù)呈負相關(guān)(

r

=-0.842，

P

<0.001；

r

=-0.861，

P

<0.05)；而對照組星型膠質(zhì)細胞數(shù)量和血清GFAP濃度與術(shù)后1 d逃避潛伏期及穿環(huán)次數(shù)無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表3。

表3 星型膠質(zhì)細胞數(shù)量與Morris水迷宮成績的相關(guān)性(n=10)

3 討論

術(shù)后認知功能障礙是麻醉術(shù)后一種常見并發(fā)癥，其發(fā)病機制一直以來也備受關(guān)注。老年人是術(shù)后認知功能障礙的高發(fā)人群，其腦組織生理結(jié)構(gòu)和功能在此過程中發(fā)生著重大變化。Morris水迷宮試驗是測試認知功能的經(jīng)典試驗之一，是公認的評價嚙齒類動物認知功能的重要試驗手段。該實驗通過單純七氟烷麻醉、七氟烷麻醉下剖腹探查術(shù)來構(gòu)建模型探討PND發(fā)病機制。Morris水迷宮實驗結(jié)果表明，術(shù)前5 d進行定位航行訓練，且隨訓練時間增加，潛伏期越來越短，表明老年大鼠存在學習能力；術(shù)后進行定位航行訓練，手術(shù)組逃避潛伏期高于麻醉組和對照組(

P

<0.05)，而麻醉組逃避潛伏期高于對照組(

P

<0.05)，這表明七氟烷和剖腹探查術(shù)均可以損害老年大鼠學習記憶能力，且七氟烷麻醉加剖腹探查術(shù)造成的學習記憶能力損害更嚴重，提示造模成功。麻醉組和麻醉手術(shù)組的術(shù)后第1天與術(shù)后第3、5天逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，而第3、5天逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學差異，第3、5天相差不大可能是因為在術(shù)后進行重復水迷宮實驗，導致大鼠具有了定位航行能力，逃避潛伏期明顯短于原組中動物術(shù)后1 d的潛伏期，訓練提高了大鼠的學習記憶能力，并可能改善了麻醉和手術(shù)對認知功能的抑制作用。有研究表明PND的持續(xù)時間在動物研究中有所不同，取決于年齡、物種和使用的手術(shù)技術(shù)，但大多數(shù)持續(xù)1～7 d。麻醉組和手術(shù)麻醉組對術(shù)后認知功能的損害是否是暫時的，該實驗對認知功能的評定只進行了6 d，有待進一步研究。麻醉手術(shù)組術(shù)后第6天穿環(huán)次數(shù)低于麻醉組和對照組(

P

<0.05)，而麻醉組穿環(huán)次數(shù)低于對照組(

P

<0.05)，表明七氟烷麻醉和剖腹探查術(shù)損害了大鼠空間記憶能力，且七氟烷加剖腹探查術(shù)損害大鼠空間記憶功能更嚴重。海馬神經(jīng)元與學習認知功能具有顯著的相關(guān)性，海馬神經(jīng)元的損傷可能是其發(fā)生認知功能障礙的主要原因。因此推測海馬區(qū)星型膠質(zhì)細胞的數(shù)量減少可能會影響神經(jīng)元的功能，進而導致認知功能障礙。該研究免疫組化染色法檢測海馬區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量，結(jié)果顯示，麻醉手術(shù)組海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量低于對照組和麻醉組(

P

<0.05)，麻醉組低于對照組(

P

<0.05)，這表明七氟烷和手術(shù)都可以導致老年大鼠海馬CA1區(qū)的星型膠質(zhì)細胞減少，但是麻醉后進行手術(shù)會更加促進老年大鼠星型膠質(zhì)細胞的減少，進而加重老年大鼠的認知功能障礙。揮發(fā)性麻醉藥的神經(jīng)毒性與大腦海馬區(qū)細胞凋亡有關(guān)，七氟烷的暴露會引起星型膠質(zhì)細胞形態(tài)的改變，繼而引起神經(jīng)元發(fā)育異常，從而導致認知功能障礙。神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星型膠質(zhì)細胞的中間絲細胞骨架蛋白，也是星型膠質(zhì)細胞的活化的分子標志物。星型膠質(zhì)細胞激活表明神經(jīng)細胞受到損傷，因此GFAP經(jīng)常作為評價腦損傷的一個重要指標。全身麻醉手術(shù)后GFAP通過血腦屏障進入血液，釋放谷氨酸及血管源性促細胞分裂素，星型膠質(zhì)細胞激活致GFAP快速合成，含量增多。該結(jié)果顯示，麻醉手術(shù)組血清GFAP濃度較麻醉和對照組升高(

P

<0.05)，而麻醉組高于對照組(

P

<0.05)，表明七氟烷麻醉和剖腹探查均可導致血清GFAP濃度升高，而麻醉加手術(shù)可致血清GFAP濃度更高，表明七氟烷麻醉和手術(shù)可加速星型膠質(zhì)細胞活化，進而損傷神經(jīng)元，導致認知功能障礙。

Pearson相關(guān)分析表明，麻醉手術(shù)組和麻醉組海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量與術(shù)后1 d逃避潛伏期呈負相關(guān)，與穿環(huán)次數(shù)呈正相關(guān)；麻醉手術(shù)組和麻醉組血清GFAP濃度與術(shù)后1 d逃避潛伏期呈正相關(guān)，與穿環(huán)次數(shù)呈負相關(guān)。而對照組海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量及血清GFAP濃度與穿環(huán)次數(shù)及術(shù)后1 d逃避潛伏期無相關(guān)性。這些結(jié)果提示海馬CA1區(qū)星型膠質(zhì)細胞數(shù)量減少、血清GFAP濃度升高可能與海馬依賴的空間學習記憶能力損害有關(guān)。