張 燦，徐美青，吳顯寧

鐵轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin,FPN)是目前唯一已知的位于細(xì)胞膜的細(xì)胞內(nèi)鐵離子輸出體，在維持細(xì)胞鐵輸出和輸入的平衡、優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)鐵離子的儲存利用及協(xié)調(diào)鐵離子之間的相互作用等方面起重要作用。當(dāng)FPN調(diào)控體系破壞，F(xiàn)PN表達水平異常，細(xì)胞內(nèi)鐵離子富集，為細(xì)胞的癌變提供有力條件。肺癌為全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌兩類，前者在原發(fā)性肺癌中占大多數(shù)。有研究表明，NSCLC的發(fā)生及進展與肺癌細(xì)胞內(nèi)鐵代謝相關(guān)，而FPN是鐵代謝途徑的關(guān)鍵蛋白。因此，該研究推測FPN在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，通過檢測FPN在肺癌中的表達及探討其在NSCLC細(xì)胞中的作用，深化對鐵代謝與肺腫瘤關(guān)系的認(rèn)知。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2018年2—10月在該院胸外科進行了手術(shù)切除的60例肺癌患者和20例肺大皰患者的標(biāo)本，其中實驗組為肺癌標(biāo)本60例，對照組為肺大皰患者手術(shù)切除的正常肺組織20例。男性44例，女性36例，年齡44～80(62.74±9.41)歲。實驗組60例中，男性32例，女性28例；按病理類型：腺癌39例，鱗癌19例，其他2例；按TNM分期：I期2例，Ⅱ期19例，Ⅲ期24例，Ⅳ期15例。對照組20例中，男性12例，女性8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 影像學(xué)、病理學(xué)等臨床資料完整；② 經(jīng)病理檢查確診為肺癌；③ 此次治療前未進行手術(shù)治療、放療、化療、靶向治療等抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并嚴(yán)重心肺功能障礙；② 合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；③ 合并嚴(yán)重代謝性疾??；④ 其他部位原發(fā)惡性腫瘤肺部轉(zhuǎn)移者；⑤ 合并消化系統(tǒng)出血、肝功能異常等影響鐵離子在體內(nèi)流通者。該研究內(nèi)容與流程設(shè)計符合該院醫(yī)學(xué)倫理委員會相關(guān)規(guī)定并獲得開展批準(zhǔn)，受試者及家屬對該研究充分知情，自愿簽署知情同意書，并積極配合工作人員。根據(jù)《 TNM惡性腫瘤分類》第8版確定TNM分期。根據(jù)世界衛(wèi)生組織第4版指南對腫瘤進行組織學(xué)亞型分類和分級。

1.2 免疫組化半定量分析

根據(jù)制造商的說明，使用通用SP檢測試劑盒(Solarbio公司，貨號：P0041)對石蠟組織切片進行染色處理。對于免疫組化(immunohistochemistry,IHC)結(jié)果的評分IRS使用十三點法的半定量分析，即以陽性細(xì)胞的百分率與陽性細(xì)胞染色強度的乘積進行評分：① 染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)：0分,陰性染色；1分,弱染色；2分,中染色；3分,強染色。② 陽性染色細(xì)胞百分比：0分,無陽性染色細(xì)胞；1分,陽性染色細(xì)胞百分比<10%；2分,陽性染色細(xì)胞百分比≥10%且<50%；3分,陽性染色細(xì)胞百分比≥50%且<80%；4分，陽性染色細(xì)胞百分比>80%。最終的IRS是染色強度評分與陽性染色細(xì)胞百分比得分的乘積。

1.3 細(xì)胞與質(zhì)粒

人支氣管上皮樣細(xì)胞系(human bronchial epithelioid cells,HBE)、肺癌細(xì)胞系(A549、H1299)由中科大生命科學(xué)院梅一德教授實驗室惠贈。慢病毒載體(PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,PCDH)、過表達對照組質(zhì)粒(PCDH-Flag,PCDH-F)和敲低組對照質(zhì)粒SCR(scrambled shFPN)均由實驗室惠贈。

1.4 主要試劑

Polybrene購自美國Sigma公司(貨號：TR-1003-G)；嘌呤霉素購自上海碧云天公司(貨號：ST551-250mg)； F12K、DMEM、Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司(貨號：23252)；兔抗人FPN多克隆抗體購自美國NOVUS公司(貨號：NBP1-88872)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，(貨號：sc-166545)；鼠抗兔及鼠抗鼠IgG-二抗購自美國Proteintech公司(貨號：SA00001-1)；TRIzol購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT試劑盒(貨號：DRR037A)及TB Green Premix Ex Taq II(貨號：RR820A)均購自美國Takara公司。

1.5 構(gòu)建PCDH-FPN-F過表達體系

查詢NCBI基因庫人FPN的基因序列，設(shè)計正義引物FPN-f。為了在FPN的N末端加載Flag標(biāo)簽，將Flag的反義序加入反義引物中FPN-r-flag。見表1。從文庫中擴增出完整的人FPN+Flag編碼序列，并將其插入到空載體PCDH的EcoR 1+Not 1位點間。通過質(zhì)粒DNA測序確認(rèn)所有構(gòu)建體PCDH-FPN-F無異常。將2 μg PCDH-FPN-F和對照載體PCDH-F及慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至6 cm培養(yǎng)皿上生長的HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12 h，將細(xì)胞用含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。收集含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基備用。其中，對照組為表達空載體質(zhì)粒PCDH-F的細(xì)胞，高表達實驗組為表達質(zhì)粒PCDH-FPN-F的細(xì)胞。

1.6 構(gòu)建shFPN敲低體系

查詢shRNA基因庫，選定5條針對人FPN的靶序列，從中國科技大學(xué)菌種庫中提取相應(yīng)的菌種(shFPN8-12)，在含5% CO的37 ℃搖床培育至對數(shù)生長期后，提取質(zhì)粒。為了構(gòu)建表達相應(yīng)shFPN的慢病毒，將2 μg shFPN8-12、對照載體SCR以及慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至6 cm培養(yǎng)皿上生長的HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12 h，將細(xì)胞用含有20% FBS的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。收集含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基，并與補充了8 μg/ml Polybrene的A549或H1299細(xì)胞孵育24 h，然后用2 μg/ml嘌呤霉素進行篩選24 h，最后通過Western blot和qRT-PCR評估敲低效率。該研究中轉(zhuǎn)染SCR質(zhì)粒的細(xì)胞為敲低對照組，敲低效率最高的shFPN-8和shFPN-9作為實驗組1和2。見表1。

表1 目的基因的引物序列

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞系使用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)；H1299、HBE和HEK293T細(xì)胞系使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基包含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素。所有細(xì)胞孵育在5% CO濃度、溫度37 ℃、飽和濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。取支原體檢測陰性、對數(shù)生長期細(xì)胞進行試驗。

1.8 Western blot實驗

收集培養(yǎng)細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，2×SDS loading中煮沸7 min。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度。將等量的總蛋白上樣至10%濃度的SDS—PAGE凝膠，120 V恒壓電泳1.5 h。然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，4 ℃ 下300 mA恒流轉(zhuǎn)移1.5 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗孵育1.5 h，二抗孵育30 min，其間均用TBST洗滌3次。用增強化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液孵育2 min，采用蛋白分析儀器拍攝后進行結(jié)果分析。

1.9 實時熒光定量PCR

按照操作說明使用TRIzol提取細(xì)胞中的總RNA；按操作說明使用PrimeScriptTM RT試劑盒取1 μg RNA合成cDNA；按操作說明使用TB Green Premix Ex Taq II在StepOnePlusTM(96孔)實時PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)中運行檢測FPN的表達，GAPDH作為內(nèi)參對照基因，引物序列見表1。通過3次獨立實驗使用2方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.10 劃痕實驗

感染慢病毒的細(xì)胞長滿24孔后，用10 μl移液器槍頭在培養(yǎng)板底部劃“一”字形劃痕，PBS漂洗貼壁細(xì)胞，棄去漂浮細(xì)胞后加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并于此后0、18、36 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕相對寬度并拍照，多個視野進行記錄。

1.11 生長曲線

感染慢病毒的細(xì)胞長滿24孔后，分別取2×10細(xì)胞各傳2個組(2 d組、4 d組)繼續(xù)培養(yǎng)，并于此2、4 d后取各組細(xì)胞計數(shù)，記錄結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 FPN在NSCLC和正常肺組織中的表達

通過IHC分析FPN在實驗組和對照組中的表達情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)PN在正常肺組織細(xì)胞膜中顯示出明顯的棕黃色染色。見圖1A；在部分NSCLC組織中未觀察到FPN陽性染色。見圖1B；在其余NSCLC組織中顯示少許棕黃色染色。見圖1C。進行半定量分析后，實驗組的IRS較對照組降低(

t

=7.391，

P

<0.005)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。Westem blot檢測HBE和A549中FPN的表達顯示，與HBE組相比， A549組中FPN的表達量也明顯降低。見圖2。

圖1 FPN的表達 HE×400A：正常肺組織；B：NSCLC組織；C：NSCLC組織

圖2 A549與HBE中FPN蛋白的表達情況與對照組A549比較：**P<0.01

2.2 FPN表達與NSCLC臨床特征的關(guān)系

在60例NSCLC癌組織中，鱗癌(squamous-cell carcinom，SCC)19例、腺癌(adenocarcinoma，ADC)39例，其IRS分別為(2.58±0.16)分和(2.36±1.50)分，

t

=0.935，

P

=0.354，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。在60例NSCLC癌組織中，Ⅰ期2例、Ⅱ期19例、 Ⅲ期24例、Ⅳ期15例，F(xiàn)PN的IRS在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=1.092，

P

=0.360)。見表2。

表2 FPN不同肺組織中表達情況比較

2.3 FPN的表達水平上調(diào)后，NSCLC細(xì)胞遷移及增殖功能變化

肺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染PCDH-FPN-F表達載體后，與對照組轉(zhuǎn)染PCDH-F進行表達驗證。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達組FPN的mRNA表達水平較對照組亦明顯上升。進一步采用Westem blot檢測FPN蛋白質(zhì)水平，結(jié)果與qRT-PCR一致，過表達組FPN蛋白水平也明顯增加，成功獲得了FPN高表達的穩(wěn)定細(xì)胞株(A549、H1299)。見圖3。穩(wěn)定高表達FPN的細(xì)胞株進一步功能實驗表明，相對于正常表達的對照組來說，過表達FPN后，實驗組的肺癌細(xì)胞向劃痕遷移的速度減慢。見圖4。同樣與對照組比較，細(xì)胞在過表達FPN后，生長2、4 d后的細(xì)胞數(shù)目少于對照組。見圖5。

圖3 穩(wěn)定高表達FPN的A549與H1299A：A549細(xì)胞中對照組與實驗組FPN蛋白及mRNA水平表達的差異；B：H1299細(xì)胞中對照組與實驗組FPN蛋白及mRNA水平表達的差異；與對照組比較：**P<0.01

圖4 細(xì)胞劃痕 ×400

2.4 下調(diào)FPN的表達水平能夠有效促進NSCLC細(xì)胞增殖生長

肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shFPN慢病毒培養(yǎng)基后，與對照組SCR進行表達驗證。qRT-PCR結(jié)果顯示，敲低組FPN的mRNA表達水平較對照組下降。進一步采用Westem blot檢測FPN蛋白質(zhì)水平，結(jié)果與qRT-PCR一致，敲低組FPN蛋白水平也明顯下調(diào)，成功獲得了FPN低表達的穩(wěn)定細(xì)胞株(A549、H1299)。見圖6。穩(wěn)定低表達FPN的細(xì)胞株進一步細(xì)胞實驗顯示，相對于正常表達的對照組來說，低表達FPN后，肺癌細(xì)胞向劃痕空白處遷移速度加快，見圖7；細(xì)胞生長速度加快，見圖5。

圖5 生長曲線A：A549和H1299細(xì)胞中高表達對照組與實驗組分別在生長0、2和4 d后的數(shù)目;B：A549和H1299細(xì)胞中敲低對照組與實驗組1、2分別在生長0、2和4 d后的數(shù)目

圖6 穩(wěn)定低表達FPN的A549與H1299A：A549細(xì)胞中敲低對照組與實驗1～5組FPN蛋白及1～2組mRNA水平表達的差異；B：H1299細(xì)胞中敲低對照組與實驗1～5組FPN蛋白及1～2組mRNA表達水平的差異；與對照組比較：*P<0.05；**P<0.01

圖7 A549和H1299細(xì)胞中對照組與實驗組1、2分別在0、18和36 h的遷移情況 ×400

3 討論

正常人支氣管肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)鐵離子的穩(wěn)態(tài)對人體健康至關(guān)重要，而FPN作為細(xì)胞內(nèi)唯一的鐵輸出蛋白在鐵離子穩(wěn)態(tài)過程中起著重要作用。之前的研究表明，鐵離子代謝紊亂，主要是鐵過載，是促進細(xì)胞惡變并最終發(fā)展為惡性腫瘤的重要原因之一。FPN對NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲、分化、凋亡及相關(guān)信號途徑有重要的影響，值得更加深入的研究。能夠為預(yù)防、診斷或治療NSCLC提供新的參考方向。

該研究通過IHC檢測肺癌標(biāo)本及正常肺組織標(biāo)本中FPN的表達，表明FPN在肺癌標(biāo)本中表達下調(diào)。可能是正常肺組織細(xì)胞在病變過程中，通過miRNA調(diào)控FPN的表達，影響FPN的生成。FPN的缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子蓄積，進而激化細(xì)胞癌變過程。該研究后續(xù)的細(xì)胞實驗中，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中FPN的表達量同樣低于HBE中的表達，符合前期實驗結(jié)果。

此外，該研究也表明，高表達FPN后，細(xì)胞會抑制其遷移及增殖能力。而敲低FPN后，這種抑制效應(yīng)會被消除。由于FPN在鐵代謝中的關(guān)鍵作用及鐵離子在細(xì)胞代謝中的重要地位，高表達FPN會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平迅速出胞，造成細(xì)胞鐵饑餓，無法為腫瘤細(xì)胞旺盛的代謝活動提供支持。腫瘤細(xì)胞的增殖速率和遷移能力都會因為缺乏必要的鐵支持而無以為繼，從而達成一種抑癌效果。而相反的是，敲低FPN會造成細(xì)胞內(nèi)鐵過載，鐵離子水平不再是肺癌細(xì)胞代謝和增殖活動的枷鎖，從而造成腫瘤細(xì)胞大量遷移增殖，形成一種致癌效應(yīng)。

此前相關(guān)研究支持鐵離子在細(xì)胞癌變中的關(guān)鍵作用。而FPN作為唯一一個已知的哺乳動物細(xì)胞鐵輸出蛋白，它在這個過程中極其重要。該實驗也證實了FPN低表達是高鐵水平和肺癌進展之間的重要樞紐。具體機制考慮與ROS有關(guān)。當(dāng)FPN表達調(diào)控體系失衡時，機體鐵穩(wěn)態(tài)紊亂，細(xì)胞內(nèi)生物活性鐵增多，催化Fenton反應(yīng)產(chǎn)生具有極高活性的活性氧成分——羥基自由基(·OH)?；钚匝踉谡T導(dǎo)DNA突變、修飾基因表達、促進腫瘤細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡、增加腫瘤侵襲和抑制抗腫瘤免疫力等方面至關(guān)重要。除此之外，也有研究表明鐵在WNT信號傳導(dǎo)、DNA合成和P53調(diào)節(jié)中均起著至關(guān)重要的作用，目前仍需要更進一步的研究。

此前研究表明，F(xiàn)PN受精密的調(diào)控系統(tǒng)控制，包括microRNA、鐵響應(yīng)元件-鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRE-IRP)系統(tǒng)和鐵調(diào)素-鐵轉(zhuǎn)運蛋白軸等。通過對FPN調(diào)控體系的深入研究，可將其作為預(yù)防、診斷及治療肺癌新靶點研究方向。目前已有研究表明包括鐵耗盡和鐵代謝靶向治療等已顯示出有效和廣泛的抗腫瘤作用，這使其成為癌癥藥物治療的潛在且基本上未開發(fā)的治療靶標(biāo),其中鐵螯合劑和氧化鐵納米顆粒(IONPs)已經(jīng)投入臨床用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和其他類型癌癥。

綜上所述，目前研究表明細(xì)胞中FPN低表達，在正常肺支氣管上皮細(xì)胞惡性進程中起重要作用。其機制可能與活性鐵、活性氧等相關(guān)。通過上調(diào)FPN表達可有效抑制肺癌細(xì)胞增殖及生長能力。這是診治肺癌的潛在方向之一。該研究尚未完全揭開FPN影響NSCLC的具體機制，仍需進一步研究。