李 蘇 雍蘇南

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

高血壓病是臨床較為常見的心血管疾病，易引起心、腦、腎等并發(fā)癥［1］。目前，高血壓病患者仍需終身治療，防治之路任重道遠(yuǎn)［2-6］。隨著科技的進(jìn)步、時(shí)代的發(fā)展，臨床中患者不僅要求單純的血壓控制，對(duì)于生活質(zhì)量的追求也越來越高。中醫(yī)藥治療高血壓病有著顯著優(yōu)勢(shì)，不僅能夠控制血壓，同時(shí)更能改善臨床伴隨癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。加味滋生青陽片為全國名中醫(yī)王行寬教授基于“虛、風(fēng)、瘀”理論，運(yùn)用養(yǎng)陰清肝、息風(fēng)通絡(luò)法治療高血壓病（肝熱血瘀證）的經(jīng)驗(yàn)方，臨床及實(shí)驗(yàn)中取得了很好的療效［7-9］，然而尚缺乏其對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎臟及相關(guān)炎癥因子影響的研究。本研究以SHR為模型，研究腎動(dòng)脈組織病理學(xué)改變與炎癥因子超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的變化，探討加味滋生青陽片對(duì)SHR腎臟保護(hù)作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 加味滋生青陽片（白芍10 g，生地黃15 g，麥冬10 g，石斛10 g，天麻10 g，石決明20 g，白蒺藜10 g，鉤藤15 g，柴胡10 g，桑葉10 g，菊花10 g，薄荷10 g，牡丹皮10 g，川芎10 g；每片相當(dāng)于原材料16 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科生產(chǎn)，批號(hào)090206，規(guī)格0.40 g/片）；替米沙坦片劑（邦坦）（江蘇萬鄭生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格40 mg/片）；血漿高h(yuǎn)s-CPR酶聯(lián)免疫分析測(cè)定盒、IL-1β酶聯(lián)免疫分析測(cè)定盒、IL-10酶聯(lián)免疫分析測(cè)定盒、TNF-α酶聯(lián)免疫分析測(cè)定盒（貨號(hào)19-0308，生產(chǎn)批號(hào)20190355）均購自武漢市博士德生物科技公司。

1.2 主要儀器 電子天平TP-2200B（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；海利士4℃冰箱（浙江海利士電器有限公司）；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（武漢生物科技有限責(zé)任公司）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀儀器設(shè)備有限公司）；CS101-A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；多功能酶標(biāo)儀MK-3（湖南中醫(yī)藥大學(xué)內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；820 Histo stat切片機(jī)（Reichert公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；MOTIC顯微圖像攝影系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；數(shù)彩圖像顯微分析系統(tǒng)BTS-20.M（廣州華粵行公司）；洗板機(jī)（芬蘭Thermo Labsystems公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 共選用SPF級(jí)12周齡雄性大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，其中WKY大鼠12只，SHR大鼠36只（購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格批號(hào)：20190120）。飼料購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。本實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物及飼料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并通過了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查，受理號(hào)：ZYFY20190203。

1.4 分組與給藥 36只SHR隨機(jī)分為模型組、中藥組、替米沙坦，每組均為12只。12只相同周齡Wistar大鼠作為空白對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均給予自由飲食、飲水，連續(xù)8周每天上午8點(diǎn)給藥，均按1 mL/kg進(jìn)行灌胃，給藥期間密切觀察所有實(shí)驗(yàn)大鼠的精神、呼吸、飲食、活動(dòng)力、飲水等狀況。按照成人臨床用藥劑量（以成人體質(zhì)量為70 kg折算）折合大鼠等效劑量，所有藥物用無菌注射用水配置成所需質(zhì)量濃度。中藥組按照3.575 g/（kg·d）給藥，替米沙坦組按照4.33 mg/（kg·d）給藥。模型組、空白對(duì)照組灌胃等體積無菌注射用水。

1.5 標(biāo)本采集與測(cè)定 1）各組大鼠進(jìn)行尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定，測(cè)量時(shí)間為灌胃前、灌胃第4、6、8周后3 h，記錄測(cè)量數(shù)值。2）各組大鼠第8周灌胃結(jié)束后禁食不禁水1 d，水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心分離血漿，采用ELISA法測(cè)定血漿hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量。3）采血后處死大鼠取腎臟，分離組織后剪取腎動(dòng)脈于4%多聚甲醛中固定、脫水、浸蠟、包埋及切片、HE染色及脫水，封片及采圖用光鏡觀察腎動(dòng)脈病理組織改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為計(jì)量資料，以（±s）表示。各組間樣本比較采用方差分析檢驗(yàn)、多重比較，若資料不滿足正態(tài)性、方差齊性，可采用秩和檢驗(yàn)或近似檢驗(yàn)等方式。P＜0.05可判斷為有差異，P＜0.01可認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組給藥前后血壓比較 見表1。給藥前：模型組、中藥組、替米沙坦組血壓均高于空白組（P＜0.01）。4周后：中藥組、替米沙坦組及空白組血壓明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；中藥組、替米沙坦組較給藥前血壓明顯下降（P＜0.05），但中藥組血壓與替米沙坦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6、8周后：中藥組、替米沙坦組及空白組血壓均明顯低于模型組（P＜0.01）；模型組較給藥前血壓上升（P＜0.05）；給藥前后對(duì)比，中藥組、替米沙坦組血壓在藥物干預(yù)后明顯下降（P＜0.01）。

表1 各組給藥前后血壓比較（mmHg，±s）

表1 各組給藥前后血壓比較（mmHg，±s）

注：與空白組比較，◇◇P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與本組給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別n 給藥前 給藥4周后 給藥6周后 給藥8周后空白組模型組中藥組替米沙坦組12 12 12 12 120.44±8.76 191.33±10.77◇◇192.26±9.20◇◇192.87±12.85◇◇123.13±7.82▲▲205.46±12.69*181.07±10.44▲*■177.37±9.99▲*121.15±10.77▲▲228.64±10.79*176.48±12.11▲*▲■169.57±11.82▲▲**121.71±8.87▲▲238.61±11.34**165.51±9.37▲▲**■164.47±10.59▲▲**

2.2 各組血漿hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α水平比較 見表2。藥物灌胃干預(yù)8周后，SHR組、替米沙坦組血漿hs-CRP值高于空白組（P＜0.05或P＜0.01），空白組、中藥組、替米沙坦組血漿hs-CRP值明顯低于SHR組（P＜0.01），但中藥組、替米沙坦組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SHR組、替米沙坦組血漿IL-1β均明顯高于空白組（P＜0.01），空白組、中藥組、替米沙坦組血漿IL-1β均明顯低于SHR組（P＜0.01）；而中藥組低于替米沙坦組（P＜0.05）。8周后各組血漿IL-10比較，空白組、中藥組、替米沙坦組均高于SHR組（P＜0.01）。但中藥組、替米沙坦組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SHR組、替米沙坦組血漿TNF-α均明顯高于空白組（P＜0.01），中藥組、替米沙坦組、空白組血漿TNF-α均明顯低于SHR組（P＜0.01），中藥組血漿TNF-α低于替米沙坦組（P＜0.05）。

表2 各組hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較（±s）

表2 各組hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較（±s）

組別空白組模型組中藥組替米沙坦組n 12 12 12 12 hs-CRP（μg/L）4.80±0.06▲▲8.40±0.34◇◇5.02±0.26▲▲5.67±0.63◇▲▲IL-1β（ng/L）47.68±1.54▲▲74.64±2.47◇◇54.44±3.34▲▲■60.63±3.18◇◇▲▲IL-10（ng/L）62.77±2.64▲▲41.64±2.15 52.07±1.71▲▲50.65±1.86▲▲TNF-α（ng/L）216.85±12.57▲▲372.19±23.20◇◇231.29±13.32▲▲■256.67±14.57◇◇▲▲

2.3 加味滋生青陽片對(duì)SHR腎動(dòng)脈病理學(xué)影響 肉眼觀察：各組腎動(dòng)脈外觀無明顯變化，在形態(tài)及色澤等方面無顯著差異。顯微鏡下觀察：空白組腎動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞完整，無炎性細(xì)胞浸潤，彈力纖維明顯，平滑肌細(xì)胞無水腫；模型組腎動(dòng)脈壁有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，以黏附為主，內(nèi)皮細(xì)胞局灶性壞死脫落，彈性纖維紊亂，平滑肌細(xì)胞排列不整齊，部分平滑肌細(xì)胞有水腫；替米沙坦組腎動(dòng)脈壁有不同程度的炎細(xì)胞黏附浸潤，以中膜平滑肌浸潤為主，內(nèi)皮細(xì)胞完整，彈性纖維排列整齊，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，無細(xì)胞水腫；中藥組腎動(dòng)脈壁少量炎細(xì)胞黏附浸潤，內(nèi)皮細(xì)胞較完整，彈性纖維排列正常，平滑肌細(xì)胞排列清晰。

圖1 各組腎動(dòng)脈病理切片（HE染色，400倍）

3 討 論

滋生青陽湯出自清代名醫(yī)費(fèi)伯雄所著的《醫(yī)醇義》，全方由生地黃、白芍、麥冬、石斛、天麻、石決明、磁石、桑葉、菊花、牡丹皮、柴胡、薄荷組成。王教授在此方基礎(chǔ)上去磁石，加白蒺藜、鉤藤、川芎，方中白芍滋養(yǎng)陰血以養(yǎng)肝體，所謂“養(yǎng)其肝血，則其用自平”；石決明、白蒺藜?xì)w肝經(jīng)，平肝潛陽，清肝明目，與白芍同用，剛?cè)嵯酀?jì)，滋養(yǎng)、平潛兼顧，可收陰平陽秘之功，三藥共為君藥。生地黃、麥冬、石斛協(xié)同白芍滋陰以固肝體；天麻、鉤藤以加強(qiáng)石決明、白蒺藜之效，同為臣藥。桑葉、菊花清肝明目；柴胡、薄荷疏肝解郁，升發(fā)青陽，引藥入肝，能遂“肝欲散，急食辛以散之”之性，共為佐藥。牡丹皮、川芎寒溫共濟(jì)，活血通絡(luò)同為使藥。全方具有養(yǎng)陰清肝、息風(fēng)通絡(luò)之功效。現(xiàn)代藥理研究證明滋生青陽片組方藥物不僅具有一定的降壓作用，而且有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗氧化、利尿、抗心肌缺血、減慢心率、抗血小板聚集等作用。

高血壓病是一個(gè)慢性炎癥過程，有多種炎癥因子參與其發(fā)生發(fā)展［10］。高血壓病在疾病的慢性炎癥過程中可激活淋巴細(xì)胞系統(tǒng)和單核細(xì)胞系統(tǒng)，并產(chǎn)生炎癥因子，對(duì)交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)產(chǎn)生影響，從而進(jìn)行血壓調(diào)節(jié)，損傷血管內(nèi)皮功能，加速血管重塑過程等［11］。在高血壓病發(fā)展過程中若某些原因使炎癥因素被清除，機(jī)體可出現(xiàn)炎癥穩(wěn)態(tài)；若某些病因?qū)е卵装Y因素持續(xù)存在，炎癥因子水平始終處于異常狀態(tài)，可使炎癥因子持續(xù)分泌并且維持在相對(duì)較高的水平，機(jī)體炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷而發(fā)生血管重塑。因此，通過各種手段降低炎癥水平，延緩或控制血管重塑已成為高血壓病的重要治療法則之一［12-13］。研究認(rèn)為，腎臟的炎癥浸潤是高血壓病的一大特征，腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)在高血壓的發(fā)生過程中扮演著重要的角色［14-15］。其影響血壓的可能機(jī)制是通過影響局部炎癥因子的釋放而影響腎臟等靶器官血管重塑，導(dǎo)致血壓升高。hs-CRP、IL-1β、TNF-α等多種細(xì)胞因子共同構(gòu)成炎癥細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，參與多種炎癥性疾病的病理過程［16］。研究證明，hs-CRP、IL-1β、TNF-α參與腎臟血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能是它們?cè)谀I臟細(xì)胞上的異常表達(dá)刺激各種生長因子的表達(dá)，作用于腎血管平滑肌細(xì)胞，加速血管重塑?？寡滓蜃覫L-10是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可抑制炎癥免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫，通過對(duì)血管外基質(zhì)及血管平滑肌細(xì)胞的影響，明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解可通過多種途徑預(yù)防、延緩腎血管重構(gòu)［17-19］。

前期臨床研究表明，滋生青陽片能降低SHR血壓，而且能逆轉(zhuǎn)左室肥厚和心肌的超微結(jié)構(gòu)損害，抑制血漿內(nèi)皮素的產(chǎn)生，降低血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及醛固酮濃度［8-9］。循環(huán)系統(tǒng)和局部組織中AngⅡ水平可在機(jī)體處于炎癥病理狀態(tài)時(shí)明顯增高［20］。而AngⅡ可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展。在本實(shí)驗(yàn)中，與相同周齡的空白組大鼠相比，模型組大鼠血壓水平不斷上升，且其腎動(dòng)脈壁有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，以黏附為主，內(nèi)皮細(xì)胞局灶性壞死脫落，彈性纖維紊亂，平滑肌細(xì)胞排列不整齊，部分平滑肌細(xì)胞有明顯水腫，并伴隨著血漿促炎因子hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10水平下降，表明炎癥反應(yīng)與自發(fā)性高血壓大鼠的腎動(dòng)脈血管重塑有著密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中藥組及替米沙坦組大鼠在藥物灌胃干預(yù)后血壓水平明顯下降，且其腎動(dòng)脈重構(gòu)現(xiàn)象存在明顯改善，同時(shí)出現(xiàn)血漿hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，而IL-10水平升高。由此我們可以推斷，血漿中炎癥因子水平對(duì)中藥組以及替米沙組大鼠的血壓下降和改善腎動(dòng)脈血管重構(gòu)產(chǎn)生了影響。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，中藥組加味滋生青陽片在延緩SHR腎動(dòng)脈血管重塑方面優(yōu)于替米沙坦，而且可以更好地降低促炎因子IL-1β、TNF-α水平。因此，我們認(rèn)為加味滋生青陽湯對(duì)SHR的腎動(dòng)脈血管重塑過程具有保護(hù)效應(yīng)，其具體機(jī)制可能和其改變血漿炎癥因子水平相關(guān)。