孫娜 姚聰 沈芯 王軍 袁純輝 向贇

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢430016）；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)（武漢430065）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種高度傳染性的慢性疾病，嚴(yán)重危害兒童健康。2018年全球新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核病兒童約112 萬(wàn)例，死亡兒童高達(dá)20 萬(wàn)［1］。兒童自身免疫力弱，感染MTB 后容易發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核，但因臨床表現(xiàn)不典型和診斷方法自身的局限性，很容易造成漏診、誤診。

MTB 為胞內(nèi)寄生菌，進(jìn)入人體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)以白細(xì)胞分化抗原CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主要應(yīng)答模式［2］。在小鼠感染模型中，CD8+T 細(xì)胞對(duì)于維持結(jié)核潛伏感染狀態(tài)至關(guān)重要［3］。顆粒酶B（granzyme B，GrB）是發(fā)揮細(xì)胞毒作用的主要效應(yīng)分子，能夠迅速引起靶細(xì)胞DNA 的斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4-5］。OUNI 等［6］報(bào)道MTB 分泌抗原Rv0140 誘導(dǎo)的GrB 能夠區(qū)分ATB和LTBI，并且淋巴結(jié)結(jié)核的發(fā)生與CD4+T 和CD8+T表達(dá)GrB 減少有關(guān)。相比于IFN?γ主要由CD4+T 細(xì)胞分泌，GrB 可由CD8+T 和CD4+T 共同分泌，對(duì)診斷結(jié)核可能具有更高的敏感度［7-8］。本研究通過(guò)檢測(cè)6 kD 早期分泌靶向抗原（ESAT?6）和10 kD 培養(yǎng)濾過(guò)蛋白（CFP?10）刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（pe?ripheral blood mononuclear cells，PBMCs）后GrB 水平，評(píng)估其作為兒童結(jié)核診斷生物標(biāo)志物的潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器AIM?V 細(xì)胞培養(yǎng)液（天津?yàn)笕A科生物科技有限公司）；ESAT?6/CFP?10 抗原（英國(guó)Oxford Immunotec 公司）；顆粒酶B 預(yù)包被ELISA試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限工司）；淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒、BV?510?anti?INF?γ、BV510?anti?Granzyme B、FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；固定液、破膜劑（美國(guó)BioLegend 公司）；血細(xì)胞分析儀XS?1000i（日本Sysmex 公司）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.2 研究對(duì)象選取2019年1?8月武漢金銀潭醫(yī)院就診的結(jié)核病患者26 例作為活動(dòng)性結(jié)核（active tuberculosis，ATB）組，包括19 例肺結(jié)核和7例肺外結(jié)核，其中男12例，女14例，年齡1 ～15歲，中位數(shù)6.5 歲；選取20 例武漢兒童醫(yī)院T?SPOT陽(yáng)性、但無(wú)臨床相關(guān)癥狀及影像學(xué)證據(jù)的為結(jié)核潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）組，其中男14 例，女6 例，年齡9 個(gè)月～13 歲，中位數(shù)6 歲；選取有咳嗽、發(fā)熱或體重減少等疑似結(jié)核臨床癥狀，但無(wú)活動(dòng)性結(jié)核病證據(jù)的患兒20 例，作為非結(jié)核病對(duì)照（Non?TB）組，其中男12 例，女8 例，年齡1 ～13 歲，中位數(shù)4 歲；另選取來(lái)本院體檢的健康兒童20 例，作為健康對(duì)照（HC）組，其中男8 例，女12 例，年齡2 ～18 歲，中位數(shù)6 歲。將ATB 和LTBI 組合并作為結(jié)核組，Non?TB 和HC 組合并作為對(duì)照組?；顒?dòng)性結(jié)核組為既往未接受過(guò)抗結(jié)核分枝桿菌治療的初治TB 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)（滿足任意一項(xiàng)）：（1）涂片抗酸桿菌或分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；（2）病理活檢提示結(jié)核；（3）臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)符合結(jié)核性改變，且抗結(jié)核治療有效。實(shí)驗(yàn)組兒童均排除HIV 感染和肝腎功能衰竭等疾病。本研究獲得武漢兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020R044?E01）。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞分離外周血2～3 mL（肝素鋰抗凝管）按照密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，使用血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)制備250 000/100 μL 的細(xì)胞工作液。在96 孔板中，每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的3 個(gè)檢測(cè)孔均加入100 μL 細(xì)胞工作液和50 μL AIM?V 細(xì)胞培養(yǎng)液，然后分別加入50 μL ESAT?6、CFP?10 溶液或AIM?V 培養(yǎng)液。37 ℃，5%CO2孵育20 h，取上清至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 GrB檢測(cè)按照GrB預(yù)包被ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將樣本按照1∶10稀釋，100 μL/孔，室溫孵育2 h。洗板后加入Biotinylated antibody 工作液，室溫1 h。顯色后使用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)6 孔板中加入單個(gè)核細(xì)胞5 ×106/孔和CFP?10 溶液，37 ℃孵育24 h。使用淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒對(duì)T 細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記染色（PerCP 抗CD45、FITC 抗CD3、APC 抗CD4、PE 抗CD8）。固定和破膜后加入BV?510?anti?INF?γ和BV?510?anti?Granzyme B。流式細(xì)胞儀檢測(cè)并用Flow Jo 軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)進(jìn)行，應(yīng)用Medcalc 軟件分析實(shí)驗(yàn)組ROC 曲線，并根據(jù)約登指數(shù)確定最佳cut?off 值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESAT?6/CFP?10 刺激后GrB 水平ESAT?6/CFP?10 抗原未刺激孔總GrB 基線水平較高，且存在個(gè)體差異，因此結(jié)核特異性GrB 的計(jì)算方法：結(jié)核特異性GrB=總GrBESAT?6刺激/CFP?10刺激-GrB培養(yǎng)液對(duì)照。ESAT?6/CFP?10 刺激后，結(jié)核組總GrB、特異性GrB水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.001），見(jiàn)表1。對(duì)結(jié)果進(jìn)行亞組分析，總GrB、特異性GrB 在ATB 組、LTBI 組、HC 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而ESAT?6 刺激后總GrB 在ATB 與Non?TB組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2、圖1。

表1 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平Tab.1 Levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10 ±s，%

表1 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平Tab.1 Levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10 ±s，%

注：***P ＜0.001，ATB 和LTBI 組合并作為結(jié)核組，Non?TB 和HC 組合并作為對(duì)照組

分組結(jié)核組對(duì)照組例數(shù)46 40總GrB ESAT?6 刺激***1 091.58±449.31 766.03±364.87 CFP?10 刺激***1 208.41±451.14 765.53±304.54未刺激768.49±262.05 753.96±262.22特異性GrB ESAT?6 刺激***323.09±219.11 12.07±114.34 CFP?10 刺激***439.92±245.99 11.58±111.02

2.2 GrB 對(duì)結(jié)核組的鑒別診斷效能以結(jié)核組和對(duì)照組作為分類變量進(jìn)行ROC 曲線分析顯示，CFP?10 刺激后總GrB、ESAT?6 特異性GrB、CFP?10特異性GrB 的最佳臨界值分別為981.86、117.93、162.81 pg/mL 時(shí)，診斷結(jié)核組的敏感度為69.57%、86.96%、86.96%，特異度為82.5%、82.5%、90%，AUC為0.793、0.923、0.96，見(jiàn)圖2。對(duì)比顯示，CFP?10 特異性GrB對(duì)結(jié)核組和對(duì)照組的鑒別診斷效能最高。

表2 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平在各亞組間的差異Tab.2 Comparison of the levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10±s

表2 ESAT?6/CFP?10 刺激后PBMCs 分泌的GrB 水平在各亞組間的差異Tab.2 Comparison of the levels of GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10±s

總GrB特異性GrB ESAT?6CFP?10ESAT?6CFP?10 970.65±339.481 040.36±361.58211.72±134.57281.43±158.66 ATB LTBI HC Non?TB P 值（ATB vs.LTBI）P 值（ATB vs.HC）P 值（ATB vs.Non?TB）P 值（HC vs.Non?TB）1 248.79±510.56 713.66±360.76 818.39±352.09 0.036 0.02 0.154 0.371 1 426.86±451.16 721.79±294.29 809.27±300.70 0.003 0.003 0.012 0.370 467.87±217.7 22.42±110.99 1.71±113.83＜0.001＜0.001＜0.001 0.574 645.94±168.32 30.55±123.67-7.4±89.56＜0.001＜0.001＜0.001 0.285

2.3 GrB 對(duì)ATB 與LTBI 組的鑒別診斷效能以ATB 組和LTBI 組作為分類變量進(jìn)行ROC 曲線分析顯示，CFP?10 刺激后總GrB、ESAT?6 特異性GrB、CFP?10 特異性GrB 的最佳臨界值分別為1 214.39、269.36、423.67 pg/mL 時(shí)，用來(lái)區(qū)分ATB與LTBI組的敏感度分別為70%、85%、90%，特異度為80.77%、76.92%、84.62%，AUC 為0.735、0.856、0.923，見(jiàn)圖3。對(duì)比顯示，CFP?10 特異性GrB 對(duì)ATB 和LTBI組的鑒別診斷效能最高。

2.4 不同方法對(duì)結(jié)核組的診斷效能比較CFP?10刺激后特異性GrB 的臨界值為162.81 pg/mL 時(shí)，與T?SPOT、抗酸染色、Xpert MTB/RIF 區(qū)分結(jié)核組的效能進(jìn)行比較顯示，特異性GrB 對(duì)結(jié)核診斷的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度均高于其余三種方法（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核的診斷效能評(píng)估Tab.3 Comparison of TB diagnosis among different detection methods

2.5 流式檢測(cè)CD8+T、CD4+T 細(xì)胞IFN?γ和GrB的表達(dá)為進(jìn)一步探究GrB 對(duì)結(jié)核診斷的潛在機(jī)制，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFP?10 刺激ATB 患者和健康對(duì)照（HC）外周血單個(gè)核細(xì)胞后CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞分泌的GrB、IFN?γ水平。結(jié)果顯示ATB組表達(dá)GrB 的CD4+T［（38.90±11.96）%］、CD8+T［（36.82±8.99）%］細(xì)胞明顯高于HC組CD4+T［（7.36±3.67）%］、CD8+T［（8.29±3.58）%］，P＜0.001）；而ATB 組僅表達(dá)IFN?γ的CD4+T［（34.18±8.07）%］細(xì)胞顯著高于HC 組［（4.06 ± 2.44）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖4。以上結(jié)果表明GrB 可由CD4+T、CD8+T 細(xì)胞同時(shí)分泌，而IFN?γ主要由CD4+T 細(xì)胞分泌。

3 討論

兒童痰液標(biāo)本采集困難，目前基于痰液標(biāo)本的多種檢測(cè)手段在結(jié)核感染診斷中具有較低的效能，如痰涂片在活動(dòng)性肺結(jié)核中的檢出率只有16.4%［9］。2017年，基于PBMCs的γ?干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA）被納入結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288?2017）。SOLLAI 等［10］人使用meta分析發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T?SPOT.TB）和QuantiFERON?TB Gold（QFT）這2 種IGRAs 對(duì)診斷兒童結(jié)核的特異度高于90%，但敏感度較低，為47%～81%。此外，2018年MYRIAM等報(bào)道IGRA在HIV 感染合并ATB 患兒中，診斷ATB 的敏感度只有29%［11-12］，這可能是由于IFN?γ主要由CD4+T細(xì)胞分泌所致。本研究發(fā)現(xiàn)CFP?10 特異性GrB 區(qū)分結(jié)核組和對(duì)照組敏感度高達(dá)86.96%，敏感度高于IGRAs。

圖1 ESAT?6/CFP?10 刺激后總GrB 和特異性GrB 的水平Fig.1 Levels of total and MTB?specific GrB in PBMCs stimulated by ESAT?6/CFP?10

圖2 ESAT?6/CFP?10 刺激后GrB 區(qū)分結(jié)核組與對(duì)照組的ROC 曲線Fig.2 The ROC curves of GrB to discriminate patients with TB from control stimulated by ESAT?6/CFP?10

圖3 ESAT?6/CFP?10 刺激后GrB 區(qū)分ATB 組與LTBI 組的ROC 曲線Fig.3 The ROC curves of GrB to discriminate patients with ATB from LTBI stimulated by ESAT?6/CFP?10

圖4 ATB 患者和HC 對(duì)照外周血CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞在CFP?10 刺激前后IFN?γ和GrB 的表達(dá)水平Fig.4 Qualitative analysis of GrB and IFN?γ expression ex vivo in CD4+/CD8+T cells stimulated by CFP?10 from patients with ATB and HC

SARKAR 等［13］研究發(fā)現(xiàn)GrB 可以作為合并感染HIV 的結(jié)核病人的一個(gè)診斷標(biāo)志物。在本研究中，結(jié)核抗原活化的CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞均能分泌GrB，同時(shí)既往文獻(xiàn)證實(shí)NK 細(xì)胞也能分泌GrB［14］，這可能是GrB 對(duì)結(jié)核診斷敏感度優(yōu)于IGRAs 的原因。QuantiFERON?TB Gold Plus（QFT?Plus）在QFT的基礎(chǔ)上添加了誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的新抗原肽段以提高敏感度，但仍不能鑒別ATB 和LTBI［15］。COMELLA?DEL?BARRIO 等［16］報(bào)道INF?γ需聯(lián)合IP10、鐵蛋白和25?羥維生素D才具有鑒別兒童ATB與LTBI 的潛力。TOGUN 等［17］研究表明檢測(cè)QFT?GIT 實(shí)驗(yàn)上清中的一些其他細(xì)胞因子（如IP?10、IL?5、IL?13）具有區(qū)分兒童LTBI 和ATB 的潛力。在本研究中，單獨(dú)GrB 就具有區(qū)分ATB 和LTBI 的潛能，這可能是由于CD8+T 細(xì)胞是控制結(jié)核潛伏感染狀態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞，GUGGINO 等［18］也證實(shí)CD8+T 分泌的顆粒酶A 可鑒別LTBI 和ATB。由上述可見(jiàn)，聯(lián)合檢測(cè)結(jié)核抗原特異性GrB 和IFN?γ可提高兒童結(jié)核診斷敏感度，并具有區(qū)分ATB和LTBI的潛能。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組抗原未刺激孔總GrB 的基線水平較高，且存在個(gè)體差異，綜合分析提出結(jié)核特異性GrB 的概念。WANG 等［19］研究報(bào)道ESAT?6/CFP?10 抗原特異性TNF?α對(duì)ATB 的診斷效能顯著優(yōu)于總TNF?α。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ESAT?6 刺激后ATB 組總GrB 在ATB 與Non?TB 組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CFP?10刺激組總GrB和特異性GrB對(duì)結(jié)核的診斷效能均優(yōu)于ESAT?6 組。原因可能是ESAT?6蛋白可通過(guò)C 端6 個(gè)氨基酸與TLR2 或是β2 微球蛋白直接相互作用，激活TBK1 和IRF3 信號(hào)軸，從而抑制宿主巨噬細(xì)胞抗原呈遞和炎癥因子釋放等多種功能，而CFP?10 則不具有免疫抑制功能［20-22］。這兩種結(jié)核抗原對(duì)GrB 釋放的分子水平差異有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

結(jié)核特異性GrB 具有作為新型結(jié)核診斷生物標(biāo)志物的潛能，對(duì)兒童活動(dòng)性結(jié)核的鑒別診斷具有重要價(jià)值。但由于兒童初治和確診為活動(dòng)性結(jié)核的標(biāo)本收集困難，本實(shí)驗(yàn)納入方法學(xué)評(píng)價(jià)的樣本例數(shù)不多，GrB 對(duì)結(jié)核的診斷效能仍需要擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。