趙俞喬 劉浪 王健崗 關(guān)滄海 王東升 鐘翔宇 姜興明

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科（哈爾濱150086）

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，其全球發(fā)病率為4.2/105，我國發(fā)病率為3.6/105［1-2］。胰腺癌預(yù)后較差且多數(shù)胰腺癌患者得到診斷時(shí)已處于晚期，胰腺癌患者的5年生存率僅為9%［3-4］。雖然外科技術(shù)在不斷細(xì)化和進(jìn)步，胰腺癌的輔助治療也取得了突破性的進(jìn)展，但是胰腺癌患者的總體生存率仍不樂觀［5-6］。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其缺乏開放性閱讀框而不具備明顯的編碼蛋白質(zhì)的能力［7-8］。大量研究顯示lncRNA 通過復(fù)雜的分子機(jī)制參與基因表達(dá)、RNA 轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程，異常表達(dá)的lncRNA 可以影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。前列腺相關(guān)轉(zhuǎn)錄本6（prostate cancer asso?ciated transcript 6，PCAT6）于角質(zhì)細(xì)胞中被首次發(fā)現(xiàn)［10］，現(xiàn)有研究證實(shí)PCAT6 在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤等中高表達(dá)，并且高表達(dá)的PCAT6 能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［11-13］。目前，關(guān)于PCAT6 在胰腺癌中的表達(dá)及作用尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在檢測PCAT6 在胰腺癌中的表達(dá)情況，并通過實(shí)驗(yàn)觀察PCAT6 對胰腺癌腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響同時(shí)解析其作用機(jī)制，以期為胰腺癌尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本及細(xì)胞系67 例胰腺癌腫瘤組織樣本及癌旁正常組織來源于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行手術(shù)切除的患者（其中男39 例，女28例；＜60歲者36例，≥60歲者31例），同時(shí)取距離胰腺癌組織5 cm 以上的癌旁正常組織為對照?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)檢查確認(rèn)為胰腺癌；（2）術(shù)前未接受化療或放療；（3）自愿參加入組且無語言交流障礙；（4）無其他內(nèi)科或外科合并癥者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院后有重大手術(shù)的患者；（2）認(rèn)知功能障礙；（3）同時(shí)伴有其他器官的惡性腫瘤。樣本離體30 min 內(nèi)置于液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。入組患者術(shù)前均簽署知情同意書，并且本研究已經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)通過。人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（normal human pancreatic duct epithelial cell，HPDE）和胰腺癌細(xì)胞系Capan?2、AsPC?1、PANC1、BxPC?3均購于美國ATCC公司。

1.1.2 試劑RPMI?1640 培養(yǎng)液、胎牛血清及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen 公司；si?PCAT6 干擾序列和si?NC 陰性對照序列購自上海吉瑪公司；RNA 抽提試劑TRIzol 購自美國Ambion 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Transwell 小室購自加拿大Costar 公司；紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000 購自美國Thermo 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix 購自中國寶日醫(yī)公司；酶標(biāo)儀microplate reader 購自瑞士Tecan 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與qRT?PCR利用TRIzol 提取組織與細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA表達(dá)水平；按試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增條件設(shè)置為95 ℃初始變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。PCAT6 上游引物序列：5′?CA?GGAACCCCCTCCTTACTC?3′，下游引物序列：5′?CTAGGGATGTGTCCGAAGGA?3′，GAPDH 上游引物序列：5′?GGGAGCCAAAAGGGTCAT?3′，下游引物序列：5′?GAGTCCTTCCACGATACCAA?3′，miR?185?5p 上游引物序列：5′?GGTGGAGAGAAAGGC?AGT?3′，下游引物序列：5′?TGCGTGTCGTGGAGTC?3′，U6 上游引物序列：5′?GCTTCGGCAGCACATAT?ACTAAAAT?3′，下游引物序列：5′?CGCTTCACGA?ATTTGCGTGTCAT?3′；采用2?ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量［14］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染Capan?2 和PANC1 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板；待細(xì)胞密度達(dá)到50%左右，更換無血清培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將si?PCAT6 和Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑加入實(shí)驗(yàn)組，并在對照組加入等量si?NC 和Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑，si?PCAT6 序列：5′?AAACAUUCCAGGGCACCGAGAGAUG?3′。轉(zhuǎn)染完成24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK?8檢測細(xì)胞增殖將Capan?2和PANC1細(xì)胞接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)0、24、48 和72 h，隨后加入10 μL CCK?8 溶液，在37 ℃、5% CO2條件下再培養(yǎng)4 h。在450 nm 波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移胰酶消化Capan?2 和PANC1 細(xì)胞后，用不含血清培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)調(diào)整濃度，在Transwell小室中加入200 μL細(xì)胞懸液（約含5×104個(gè)細(xì)胞），小室下層充滿10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2條件下再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞膜，室溫下用多聚甲醛固定15 min 后染色，高倍顯微鏡下拍照，并用Image J 軟件計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)需在Transwell 小室上層預(yù)先涂滿Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探究PCAT6 和miR?185?5p 之間的調(diào)控關(guān)系。將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、Renilla 熒光素酶報(bào)告pRL?CMV 質(zhì)粒分別和miR?185?5p mimics 或miR?mimics NC 共轉(zhuǎn)染Capan?2 和PANC1 細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的說明書進(jìn)行熒光素酶活性檢驗(yàn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用Fisher 精確檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCAT6在胰腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)qRT?PCR 檢測結(jié)果顯示，PCAT6 在67 例胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.001；圖1A）。臨床病理資料相關(guān)性分析顯示，PCAT6表達(dá)水平僅與TNM分級（P=0.010）密切相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小等因素?zé)o相關(guān)（表1）。此外，相較于HPDE 細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞（Capan?2、AsPC?1、PANC1、BxPC?3）中PCAT6 的表達(dá)水平明顯提高（P＜0.001，圖1B）。

注：A，PCAT6 在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織；B，PCAT6在4 株胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于HPDE.*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001

2.2 下調(diào)PCAT6 表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移CCK?8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與si?NC 組相比，si?PCAT6 轉(zhuǎn)染后的Capan?2 和PANC1 細(xì)胞活性在48 h、72 h顯著下降（P＜0.05，圖2A），這一結(jié)果表明沉默PCAT6 能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。利用Transwell 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究PCAT6 對于胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染si?PCAT6 的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯少于對照組，同時(shí)在擦除基質(zhì)膠后可觀察到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在Transwell 小室內(nèi)層的侵襲數(shù)目減少（P＜0.05，圖2B）。上述結(jié)果提示胰腺癌中高表達(dá)的PCAT6可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

表1 PCAT6 表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab.1 Association between the clinicopathological characteristics of PDAC patients and the PCAT6 expression例

2.3 PCAT6 在胰腺癌細(xì)胞中靶向調(diào)控miR?185?5p 的表達(dá)Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示：miR?185?5p 可能是PCAT6 調(diào)控胰腺癌的潛在下游靶點(diǎn)（圖3A）。利用qRT?PCR 檢測發(fā)現(xiàn)miR?185?5p 在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)（P＜0.05，圖3B）；轉(zhuǎn)染si?PCAT6 后miR?185?5p 表達(dá)水平較于與si?NC 組顯著升高（P＜0.05，圖3C）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，PCAT6?WT+miR?185?5p mimics 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著低于PCAT6?WT+miR?mimics NC 共轉(zhuǎn)染組，而PCAT6?WUT+miR?185?5p mimics 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與PCAT6?WUT+miR?mimics NC 共轉(zhuǎn)染組無明顯差異（圖3D）。以上結(jié)果提示，PCAT6 可以通過海綿吸附作用調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中miR?185?5p 的表達(dá)。

圖2 沉默PCAT6 對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig.2 Effects of PCAT6 silencing on proliferation，migration and invasion of pancreatic carcinoma cells

3 討論

隨著研究的深入，有關(guān)lncRNA 在腫瘤中的作用不斷被揭示，其對腫瘤的促進(jìn)和抑制作用也為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路和途徑［15-16］。胰腺癌是一種對放化療敏感性不高且預(yù)后極差的惡性腫瘤，同時(shí)由于其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)病情已發(fā)展至晚期［17-18］。有大量研究報(bào)道了lncRNA 在胰腺癌進(jìn)展過程中發(fā)揮的重要調(diào)控作用：linc00511 在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了關(guān)鍵的調(diào)控作用；MALAT1可以作為競爭性內(nèi)源RNA結(jié)合miR?217 進(jìn)而調(diào)控kirsten 大鼠肉瘤的生長［19-20］。PCAT6 是一種新發(fā)現(xiàn)的在多種腫瘤中均能發(fā)揮調(diào)控作用的lncRNA，其在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤、肝細(xì)胞癌、宮頸癌、膽管癌和胃癌［21-23］等多種腫瘤中高表達(dá)并發(fā)揮促癌作用。但目前l(fā)n?cRNA PCAT6 在胰腺癌中的表達(dá)情況及調(diào)控作用尚未明確。

圖3 LncRNA PCAT6 靶向調(diào)節(jié)miR?185?5pFig.3 The targeting regulation of miR?185?5p by the lncRNA PCAT6

本研究首先利用qRT?PCR 技術(shù)檢測PCAT6 在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，與相應(yīng)的正常胰腺組織和細(xì)胞對比，PCAT6 的表達(dá)水平顯著上升，并且高表達(dá)的PCAT6 與胰腺癌的TNM 分期和淋巴結(jié)侵襲密切相關(guān)。為進(jìn)一步探究PCAT6 對胰腺癌的調(diào)控作用，利用si?PCAT6 和si?NC 分別轉(zhuǎn)染Ca?pan?2 和PANC1 細(xì)胞，結(jié)果顯示胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低。此外，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析證實(shí)miR?185?5p 是PCAT6 的潛在下游靶點(diǎn)，qRT?PCR結(jié)果顯示miR?185?5p 的表達(dá)水平與PCAT6 呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果提示PCAT6 在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，通過海綿吸附作用調(diào)控miR?185?5p 的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)胰腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PCAT6 在胰腺癌中高表達(dá)并與患者TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且可以通過靶向miR?185?5p 來調(diào)控抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。