柏效治 謝小娟 原翔 劉怡文 孔金玉 孫蔚 李燕樂

1河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院開元院區(qū)麻醉科（河南洛陽471003）；2河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室（河南洛陽471003）

癌癥是全球第二大死亡原因，預計全球新發(fā)癌癥病例的總發(fā)病人口將從2012年的1400 萬增加到2035年的2400 萬［1］。卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)卵巢癌患者在疾病治療中需接受手術(shù)和麻醉。丙泊酚作為一種最廣泛使用的短效靜脈麻醉藥，其術(shù)中應(yīng)用與腫瘤患者疾病轉(zhuǎn)歸的影響一直是麻醉科醫(yī)師關(guān)注的熱點問題之一。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細胞水平，丙泊酚能夠抑制肝癌、食管癌、肺癌等的腫瘤細胞惡性生物學行為［2-4］，但丙泊酚抗腫瘤作用的分子機制不盡相同。Yes 相關(guān)蛋白（yes?related protein，YAP）是近年發(fā)現(xiàn)的Hippo 信號通路下游一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其在卵巢癌中的高表達與腫瘤惡性程度及不良預后密切相關(guān)。本研究通過觀察丙泊酚對卵巢癌SKOV3 細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響，并檢測細胞YAP 的表達量變化，探討丙泊酚對卵巢癌腫瘤惡性生物學的影響及其調(diào)控的分子機制，以期為卵巢癌手術(shù)中丙泊酚的使用和圍術(shù)期鎮(zhèn)靜藥物的選擇提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑卵巢癌SKOV3 細胞（中國科學院上海細胞庫），慢病毒包裝試劑盒（GeneCopeia公司，美國），YAP抗兔單克隆抗體（Abcam公司，英國）等。

1.2 實驗分組觀察丙泊酚對SKOV3 細胞增殖、遷移及侵襲能力，將實驗分為空白對照組（C 組），溶劑對照組（D 組），25 μmol/L 濃度的丙泊酚處理組（P25 組），50 μmol/L 濃度的丙泊酚處理組（P50組），100 μmol/L 濃度的丙泊酚處理組（P100組）；觀察YAP 過表達后是否干預丙泊酚對SKOV3 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，將實驗分為SKOV3?GFP 組（對照組）、SKOV3?YAP 組（過表達組）、使用propofol?SKOV3?GFP 組（丙泊酚+對照組）和propofol?SKOV3?YAP 組（丙泊酚+過表達組），分組中的丙泊酚處理濃度為50 μmol/L。

1.3 細胞功能學實驗

1.3.1 CCK?8 實驗取對數(shù)生長期細胞，接種至96 孔板中（1 × 103個/每孔），使用不同濃度丙泊酚的完全培養(yǎng)基進行換液，計時為0 h；在不同時間加入10 μL CCK?8 試劑，孵育2 h，測出450 nm 時吸光度；實驗重復3 次。

1.3.2 平板克隆實驗取含有不同藥物濃度的細胞懸液2 mL（750 個細胞/mL），接種于6 孔板中混勻，每組重復3 個樣本；混勻細胞培養(yǎng)2 ～4 周；當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，洗滌，固定，染色，計數(shù)、拍照。

1.3.3 劃痕實驗標記6 孔板，制備細胞懸液（1×105個/mL）；使用不同藥物濃度的完全培養(yǎng)基進行細胞換液，以此作為0 h，拍照，標記位置，繼續(xù)培養(yǎng)24 h時，對標記處位置再次進行拍照；使用Image J 軟件測量同一位置不同時間點的劃痕面積。

1.3.4 Transwell侵襲實驗Matrigel膠包被Transwell小室基底膜；將細胞懸液100 μL 加入Transwell 小室上室；小室下部加入550 μL 含10%血清的對應(yīng)藥物濃度的完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h 后，洗滌、固定、染色，將小室放置于倒置顯微鏡上，拍照；并計數(shù)穿過微孔膜的細胞數(shù)，每組細胞設(shè)置3 個復孔。

1.4 免疫熒光實驗向培養(yǎng)皿中加入1×103個細胞，待完全貼壁，加入不同藥物濃度的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；甲醛固定，BSA封閉1 h，4 ℃一抗過夜后；熒光二抗孵育1 h，核染色后，共聚焦顯微鏡下拍照。

1.5 Western blot 實驗細胞生長至培養(yǎng)皿面積的80%～90%時，加入蛋白裂解液200 μL，刮下蛋白，BCA 蛋白定量。將樣本加入10%SDS?聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA 封閉1 h；4 ℃下一抗過夜，復溫2 h；二抗孵育2 h；加入顯影液，曝光顯影，保存分析。

1.6 構(gòu)建YAP 蛋白過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKOV3 細胞系使重組慢病毒質(zhì)粒于293Ta 包裝細胞中表達、包裝成具有感染活性的慢病毒顆粒并分泌進入細胞的培養(yǎng)基中。提取有感染活性的慢病毒顆粒與目的細胞共同培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，Western blot 驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.7 統(tǒng)計學方法使用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料使用均數(shù)±標準差表示；比較采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對卵巢癌SKOV3 細胞增殖、遷移及侵襲能力影響實驗結(jié)果顯示D組與C組相比，SKOV3細胞的增殖、遷移及侵襲能力差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CCK?8實驗結(jié)果顯示在24 h時間點，與C 組相比，P50、P100組對SKOV3 細胞的增殖能力有抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），在36、48、60 h 時間點，P25、P50、P100組對SKOV3 細胞的增殖能力影響與對應(yīng)時間點的C 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。劃痕實驗結(jié)果顯示丙泊酚能抑制卵巢癌SKOV3 細胞的遷移能力，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示丙泊酚能抑制卵巢癌SKOV3 細胞的侵襲能力，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖1、表1。

圖1 CCK?8 實驗檢測丙泊酚對卵巢癌SKOV3 細胞系增殖能力的影響Fig.1 CCK8 test to detect the effect of propofol on the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cell line

表1 平板克隆、劃痕實驗、Transwell 侵襲實驗檢測丙泊酚對卵巢癌SKOV3 細胞系遷移能力的影響Tab.1 Colony forming assay、wound healing、Transwell invasion assay was used to detect the effect of propofol on migration ability of ovarian cancer SKOV3 cell line ±s

表1 平板克隆、劃痕實驗、Transwell 侵襲實驗檢測丙泊酚對卵巢癌SKOV3 細胞系遷移能力的影響Tab.1 Colony forming assay、wound healing、Transwell invasion assay was used to detect the effect of propofol on migration ability of ovarian cancer SKOV3 cell line ±s

注：*表示與空白對照組相比P ＜0.05；△表示P50組、P100組與P25組相比差異有統(tǒng)計學意義；▲表示P100組與P50組相比差異有統(tǒng)計學意義

分組C 組D 組P25組P50組P100組鋪板1 000 個細胞/孔的成瘤數(shù)211.000±8.718 205.000±10.392 176.333±11.624 128.000±13.229*△88.000±6.429*△▲劃痕實驗24 h后遷移面積（mm2）20.731±0.454 20.575±0.749 15.262±0.288*11.362±0.435*△8.788±0.428*△▲24 h 穿過微孔膜下層的細胞114.333±5.207 115.667±7.219 87.000±7.767*74.333±7.881*58.333±6.173*△

2.2 丙泊酚對SKOV3 細胞中YAP 蛋白表達的影響細胞免疫熒光結(jié)果顯示YAP 蛋白主要位于細胞核內(nèi)，丙泊酚能夠下調(diào)SKOV3 細胞中YAP 蛋白的表達，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），隨著丙泊酚濃度的增加，SKOV3 細胞核中YAP 蛋白的表達量逐漸減少（表2、圖2）。Western blot 結(jié)果顯示丙泊酚能夠下調(diào)SKOV3 細胞中YAP 蛋白的表達，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），隨著藥物濃度的增加，丙泊酚對SKOV3 細胞中YAP 蛋白表達的抑制作用增強（表3、圖3）。

表2 細胞免疫熒光法檢測丙泊酚對SKOV3 細胞中YAP蛋白表達的影響Tab.2 The effect of propofol on the expression of Yap protein in SKOV3 cells was detected by immunofluorescence x±s

圖2 細胞免疫熒光法檢測丙泊酚對SKOV3 細胞中YAP 蛋白表達的影響Fig.2 The effect of propofol on the expression of Yap protein in SKOV3 cells was detected by cell immunofluorescence method

表3 Western blot 檢測丙泊酚對SKOV3 細胞中YAP 蛋白表達的影響Tab.3 Western blot was used to detect the effect of propofol on Yap protein expression in SKOV3 cells x±s

2.3 建立卵巢癌SKOV3細胞YAP過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系分為SKOV3?GFP 熒光對照組和SKOV3?YAP 過表達組，使用共聚焦顯微鏡觀察兩組細胞的轉(zhuǎn)染效率，Western?blot 結(jié)果顯示YAP 過表達后的SKOV3 細胞中YAP蛋白表達量明顯增加，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4、圖4。

圖3 Western blot 檢測丙泊酚對SKOV3 細胞中YAP 蛋白表達的影響Fig.3 Western blot was used to detect the effect of propofol on Yap protein expression in SKOV3 cells

2.4 YAP 過表達干預丙泊酚對SKOV3 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響將實驗分為SKOV3?GFP組（對照組）、SKOV3?YAP 組（過表達組）、propofol?SKOV3?GFP組（丙泊酚+對照組）和propofol?SKOV3?YAP 組（丙泊酚+過表達組）。CCK?8、平板克隆、劃痕實驗、Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示SKOV3?YAP組與SKOV3?GFP 組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SKOV3?YAP 組與propofol?SKOV3?YAP組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；propofol?SKOV3?GFP 組與propofol?SKOV3?YAP 組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。提示YAP 過表達后，SKOV3 細胞的增殖、遷移及侵襲能力均增強，YAP 過表達后干預丙泊酚對SKOV3 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

圖4 建立YAP 過表達的SKOV3 細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系Fig.4 The stable transfection cell line of SKOV3 cells overexpressing Yap was established

表4 Western blot 檢測SKOV3 細胞系中YAP 過表達效率Tab.4 The overexpression efficiency of Yap in SKOV3 cell line was detected by Western blot ±s

表4 Western blot 檢測SKOV3 細胞系中YAP 過表達效率Tab.4 The overexpression efficiency of Yap in SKOV3 cell line was detected by Western blot ±s

注：*表示與對照組相比P ＜0.05

組別SKOV3 YAP?SKOV3 YAP 灰度值/GAPDH 灰度值0.723±0.068 1.130±0.112*t 值5.355 P 值0.006

3 討論

麻醉藥物和麻醉方法等因素可能引起圍術(shù)期腫瘤微環(huán)境的改變，導致術(shù)后腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移［5-6］。目前，手術(shù)仍是卵巢癌的重要治療手段，圍術(shù)期管理對降低術(shù)后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的影響一直是麻醉科醫(yī)生關(guān)注的重點。丙泊酚可能通過調(diào)控MAPK、NF?ΚB、HIF?α等信號通路的激活狀態(tài)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但不同腫瘤細胞中調(diào)控惡性生物學行為的主要信號通路不同，導致丙泊酚對不同類型的腫瘤細胞可能產(chǎn)生不同的影響［7-8］。回顧既往研究，丙泊酚對卵巢癌細胞的惡性生物學行為的影響作用仍不明確。觀察丙泊酚對卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響，進一步探討其潛在機制，能夠為丙泊酚應(yīng)用于卵巢癌手術(shù)患者提供依據(jù)，為臨床醫(yī)生通過麻醉藥物改善腫瘤患者預后提供新的思路，同時也為腫瘤患者個體化、精細化麻醉管理的發(fā)展提供證據(jù)支持。

圖5 YAP 過表達干預丙泊酚對SKOV3 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響Fig.5 Yap overexpression interferes with the effect of propofol on proliferation，migration and invasion of SKOV3 cells

通過CCK?8實驗發(fā)現(xiàn)，丙泊酚抑制SKOV3細胞的增殖能力，且隨著丙泊酚濃度的增加，其抑制作用也越明顯；通過劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚對卵巢癌SKOV3 細胞的體外遷移和侵襲能力有抑制作用，且隨著丙泊酚濃度的增加，其抑制作用也越明顯。該結(jié)果與HUANG等［9］關(guān)于丙泊酚對卵巢癌ES2 細胞系中的研究結(jié)果相似，由此推斷丙泊酚可能對卵巢癌的多個不同細胞系都存在潛在的抑制作用。

由YAP 的基因突變或表達異常引起的Hippo?YAP 通路的調(diào)控失常可導致細胞增殖/凋亡失衡和腫瘤形成［10］。在非小細胞肺癌中，YAP可通過調(diào)控lncRNA MALAT1 的表達促進腫瘤的增殖和遷移［11］；劉虹等［13］通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，下調(diào)大腸癌細胞株YAP 表達后，癌細胞的增殖和侵襲能力被明顯抑制；miR?877?5p 可以通過靶向YAP1 抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲［13］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Hippo?YAP 通路在卵巢癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［14-15］。LI 等［16］研究認為，丙泊酚能夠通過調(diào)控YAP 信號通路保護海馬神經(jīng)元缺血再灌注損傷。本研究免疫熒光實驗和蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示丙泊酚成濃度依賴性下調(diào)了卵巢癌SKOV3 中YAP 蛋白的表達量。當使用丙泊酚處理后，過表達YAP 的SKOV3 細胞的增殖、遷移及侵襲能力仍能被丙泊酚抑制。因此，丙泊酚對SKOV3 細胞的生物學活性影響與YAP密切相關(guān)。由此推測丙泊酚可能通過下調(diào)YAP 蛋白的表達進而影響Hippo 通路下游的轉(zhuǎn)錄因子CTGF、survivin 等抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力，另外丙泊酚也可影響與Hippo 信號通路有交互作用的其他信號通路，進而影響腫瘤的惡性生物學行為，具體機制仍需進一步實驗證實。

綜上所述，丙泊酚對SKVO3 細胞的體外增殖、遷移及侵襲能力有抑制作用，其機制可能與通過下調(diào)Hippo 信號通路中YAP 蛋白的表達有關(guān)。鑒于丙泊酚在體外實驗中對于卵巢癌細胞的作用，可以為卵巢癌患者手術(shù)中鎮(zhèn)靜藥物的選擇提供參考。