劉洋 孫岳 楊安寧 劉子歌 劉太陽 郝瑋 劉耀陽 王秋實(shí) 劉志宏

寧夏醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3臨床醫(yī)學(xué)院（銀川750004）；4國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種脂質(zhì)驅(qū)動的動脈內(nèi)膜炎癥性疾病，是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)［1］。鐵死亡是一種鐵依賴的氧化性細(xì)胞死亡，其特征是細(xì)胞內(nèi)鐵的增加和抗氧化能力的降低導(dǎo)致過氧化脂質(zhì)的致死性積累［2］，鐵死亡已被證明對多種疾病具有重要意義。脂質(zhì)過氧化、斑塊內(nèi)出血和鐵沉積是晚期人類AS 斑塊的特征［3］，這是AS 中鐵死亡發(fā)生的間接證據(jù)。已有研究證實(shí)［4］抑制鐵死亡可以減輕小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和AS。動脈內(nèi)膜中巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成是早期AS 病變的主要標(biāo)志，且在AS 發(fā)生發(fā)展的各個階段都起著重要作用，但鐵死亡在泡沫細(xì)胞及AS 形成中的作用尚不清楚。因此，本文擬從泡沫細(xì)胞鐵死亡角度出發(fā)，探討ox?LDL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化以及高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠AS 過程中是否有鐵死亡發(fā)生，并討論了泡沫細(xì)胞鐵死亡在晚期斑塊中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動脈粥樣硬化動物模型制備本次研究選用6 ～8 周齡雄性ApoE-/-小鼠，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心。12只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組（n=6）：（1）對照組：普通飼料喂養(yǎng)；（2）模型組：高脂飼料（1.25%膽固醇）喂養(yǎng)。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，小鼠飼養(yǎng)16 周后處死，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。整個實(shí)驗(yàn)過程符合寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物使用倫理規(guī)定。

1.1.2 正常RAW264.7 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及泡沫細(xì)胞模型的復(fù)制RAW 264.7巨噬細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基+1%雙抗）培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為Control 組和Ox?LDL 組，Control 組給予常規(guī)培養(yǎng)基，Ox?LDL 組給予含有50 mg/L ox?LDL 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，即為RAW264.7 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型［5］。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備H&E 染色試劑盒（碧云天，中國）；油紅O 檢測試劑盒（索萊寶，北京）；RNA 提取試劑盒（天根，中國）；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 試劑盒（賽默飛，美國）；熒光定量PCR 儀（楓嶺國際，上海）；谷胱甘肽檢測試劑盒（南京建成，中國）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貝博，中國）；鐵離子比色法檢測試劑盒（普利萊，北京）；蛋白提取試劑盒（凱基，南京）；p53、GPX4 和SLC7A11抗體（abcam，美國）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（博奧森，北京）；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco，美國）；電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（Rio?Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平檢測全自動生化分析儀檢測小鼠血清中TG、TC、LDL?C 和HDL?C 的含量。

1.2.2 H&E 和油紅O 染色觀察小鼠主動脈根部斑塊面積大小和脂質(zhì)沉積H&E 染色：多聚甲醛固定冰凍切片，流水清洗后蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化后流水沖洗返藍(lán)，隨后伊紅染色，梯度脫水透明后封片，光鏡下觀察。

油紅O 染色：多聚甲醛固定冰凍切片，60%異丙醇浸洗，油紅O 染色，蘇木素復(fù)染，流水沖洗返藍(lán)，1%鹽酸乙醇分化，封片后在光鏡下觀察。

1.2.3 qRT?PCR 檢測泡沫細(xì)胞及主動脈組織中p53、GPX4 和SLC7A11 mRNA 表達(dá)水平取主動脈組織或細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取總RNA，測定濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入擴(kuò)增反應(yīng)體系運(yùn)用qRT?PCR 法擴(kuò)增。本次引物由上海生物工程公司合成，引物序列見表1。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.2.4 Western blot 法測定泡沫細(xì)胞及主動脈組織p53、GPX4 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平取主動脈組織或細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白。制備蛋白樣品后進(jìn)行SDS?PAGE 電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，加入ECL 發(fā)光底物顯色后，使用凝膠成像儀成像。以目的蛋白與β?actin 蛋白光密度的比值反映目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.5 泡沫細(xì)胞中ROS、GSH、MDA 和Fe2+水平的檢測熒光探針DCFH?DA 檢測各組細(xì)胞內(nèi)過氧化標(biāo)志物ROS 水平，比色法觀察各組細(xì)胞內(nèi)GSH、MDA 和Fe2+水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的建立血脂膽固醇水平檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL?C 水平顯著升高（P＜0.01），HDL?C 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）；H&E和油紅O染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠主動脈根部可見內(nèi)膜增厚，管腔明顯狹窄，有明顯粥樣斑塊形成，且存在大量脂滴沉積，油紅O 陽性面積占比較大（P＜0.01，圖2）。表明ApoE-/-小鼠AS 模型構(gòu)建成功。

圖1 小鼠血清中TC、TG、HDL?C 和LDL?C 的含量Fig.1 Content of TC、TG、HDL?C and LDL?C in mice serum

圖2 小鼠主動脈根部橫切面H&E 和油紅O 染色（20×）Fig.2 Mouse aortic root cross sections were separately stained with H&E and Oil Red O（20×）

2.2 高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠主動脈組織中鐵死亡相關(guān)基因mRNA 和蛋白的表達(dá)采用qRT?PCR 及Western blot 分別檢測主動脈組織中鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對照組相比較，模型組p53的mRNA表達(dá)明顯上升（P＜0.01），GPX4和SLC7A11的mRNA 表達(dá)呈降低趨勢（均P＜0.05，圖3）。蛋白表達(dá)與上述mRNA 表達(dá)改變相一致（P＜0.05，圖4）。證實(shí)高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS 中鐵死亡的發(fā)生。

圖3 小鼠主動脈組織中鐵死亡相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)Fig.3 The mRNA expression of ferroptosis?related genes in mice aorta

圖4 對照組和模型組中鐵死亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)Fig.4 The protein expression of ferroptosis?related genes in mice aorta

2.3 RAW264.7 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立選擇大小均一、生長狀態(tài)良好的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，用含50 mg/L 的ox?LDL 刺激后通過油紅O觀察，胞漿中有紅色脂滴，由此泡沫細(xì)胞模型建立成功，見圖5。

圖5 建立RAW264.7 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型（20×）Fig.5 Establishment of RAW264.7 macrophage?derived foam cell model（20×）

2.4 ox?LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞發(fā)生鐵死亡為了進(jìn)一步明確鐵死亡在泡沫細(xì)胞中的作用，采用qRT?PCR 及Western blot 分別檢測兩組細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。與Control 組相比，Ox?LDL 組GPX4 和SLC7A11 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01），而p53 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），見圖6。隨后檢測了p53、GPX4 和SLC7A11 蛋白表達(dá)，與Control 組相比，Ox?LDL 組p53 蛋白表達(dá)升高（P＜0.001），GPX4 和SLC7A11表達(dá)水平降低（均P＜0.01），說明ox?LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞有鐵死亡發(fā)生，見圖7。

圖6 Control 組和Ox?LDL 組中鐵死亡相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)Fig.6 The mRNA expression of ferroptosis?related genes in Control and Ox?LDL groups

2.5 ox?LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物和鐵含量增加觀察兩組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物、GSH 和鐵離子水平變化，結(jié)果顯示，與Control 組相比，Ox?LDL 組細(xì)胞ROS、MDA 表達(dá)水平明顯增高（均P＜0.01），而GSH 含量顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)e2+含量升高（P＜0.05），見圖8。

3 討論

隨著AS 的發(fā)生發(fā)展，泡沫細(xì)胞逐漸在動脈內(nèi)膜中堆積形成脂質(zhì)斑塊，當(dāng)動脈壁中的脂質(zhì)斑塊發(fā)生破裂，繼發(fā)血栓形成，導(dǎo)致各種急慢性心血管疾病事件及其他并發(fā)癥發(fā)生［6-8］。巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞死亡是晚期斑塊的突出特征，也是導(dǎo)致壞死核心形成和斑塊不穩(wěn)定的主要因素。脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致AS 的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。鐵累積和脂質(zhì)過氧化是鐵死亡發(fā)生的重要機(jī)制，也是AS 發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素［9］。因此探究鐵死亡與AS 的關(guān)系，對于AS 的機(jī)制研究與防治具有重要意義。

圖7 Control 組和Ox?LDL 組中鐵死亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)Fig.7 The protein expression of ferroptosis?related genes in Control and Ox?LDL groups

圖8 ox?LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞中ROS、MDA、GSH 和Fe2+表達(dá)水平的影響Fig.8 The content of ROS，MDA，GSH and Fe2+in ox?LDL?induced foam cell

有研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS 模型的肝細(xì)胞損傷過程中有鐵死亡發(fā)生［10］。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物積累導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂過氧化是細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵驅(qū)動因素［11］，而抗氧化劑GPX4/GSH 體系在抑制這種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［12］。SLC7A11 是谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)（System Xc-）的一個組成部分［13］，攝入的胱氨酸合成GSH 通過與GPX4 結(jié)合，發(fā)揮清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的作用。抑制Xc?轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)導(dǎo)致合成GSH的前體半胱氨酸嚴(yán)重耗竭并伴隨細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力不足，同時GSH 依賴的酶如GPX4［14］活性也會下降。p53 則可通過抑制SLC7A11 表達(dá)、增加ROS 的生成，來加快鐵死亡進(jìn)程［15］。基因和蛋白結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠SLC7A11 和GPX4表達(dá)水平顯著降低，而p53 的表達(dá)水平則顯著上升，提示鐵死亡參與高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS的發(fā)生發(fā)展過程，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在AS 斑塊中，泡沫化的巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡或非凋亡形式的程序性死亡，釋放形成壞死核心的細(xì)胞成分和脂質(zhì)，是導(dǎo)致AS 斑塊不穩(wěn)定和易損的關(guān)鍵病理因素之一［16］。故本研究推測，泡沫細(xì)胞形成過程可能有鐵死亡發(fā)生。結(jié)果顯示，使用ox?LDL 處理后，Western blot 及qRT?PCR 檢測到泡沫細(xì)胞中p53 表達(dá)水平增加，SLC7A11 和GPX4 的表達(dá)水平降低，并且細(xì)胞損傷和脂質(zhì)過氧化作用加重，表現(xiàn)為ROS、MDA 的生成增加，抗氧化劑GSH 的減少，細(xì)胞內(nèi)的鐵離子水平也有所升高。結(jié)果提示ox?LDL 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞來源泡沫細(xì)胞中有鐵死亡發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS 中有鐵死亡的參與，且ox?LDL 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞泡沫化過程中有鐵死亡參與。故針對死亡類型的藥理學(xué)靶向方法是穩(wěn)定易損斑塊的一種有前途的方法，但泡沫細(xì)胞鐵死亡在AS 中的具體作用機(jī)制，還需更進(jìn)一步的研究。