翟金海 張佳怡 徐速

1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院（江蘇鹽城224008）；2南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（南京210001）；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院（江蘇鹽城224001）

克羅恩病（crohn disease，CD）是一種慢性非特異性肉芽腫性炎癥［1］，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，通常被認(rèn)為與免疫因素有關(guān)，是消化科常見難治性疾病之一。由于腸壁的慢性炎癥反復(fù)刺激，形成了整個(gè)腸纖維化層，導(dǎo)致腸道狹窄甚至梗阻。CD導(dǎo)致的腸腔狹窄等嚴(yán)重并發(fā)癥［2］，常需手術(shù)治療。CD 活動(dòng)期患者外周血小板的異常增高與活化，常與活動(dòng)程度相關(guān)性較高，可作為疾病活動(dòng)度的一個(gè)評(píng)估指標(biāo)［3］。近幾年國內(nèi)外對(duì)腸纖維化的發(fā)病機(jī)制有較多研究進(jìn)展，其中血管生成被認(rèn)為是其中十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)［4］，但目前還沒有從干預(yù)血管生成的角度來改善腸纖維化的研究。本實(shí)驗(yàn)通過觀察比較加入PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 前后，IMECs 細(xì)胞遷移、管腔形成能力的變化來研究活化的血小板對(duì)IMECs 血管生成的影響。觀察對(duì)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路磷酸化相關(guān)蛋白及HIF?1α的蛋白表達(dá)的影響，以及對(duì)纖維化相關(guān)因子E?cadherin、α?SMA、CollagenI 蛋白表達(dá)變化和基因表達(dá)水平的影響，探討血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞的EMT 的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大鼠IMECs 細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液和胰蛋白酶EDTA（美國GIBCO 公司），胎牛血清（Biologi?cal Industries，批號(hào)：1418110），Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司Cat.No.2010242），Streptomycin Sulfate（AMRESCO 公司Cat.No.2010382），NaHCO3（美國Gibco 公司Cat.No.11810?033），Trypsin（AM?RESCO公司Cat.No.2010/04），Trizol（美國Invitrogen公司Cat No.15596?026），SDS：santacruze公司（Cat No.sc?264510），PVDF 轉(zhuǎn)移膜（DOCLAB 公司Cat No.16220405），anti E?cadherin（美國Bioworld 公司），Antiα?SMA（Cell Signaling，美國；編號(hào)19245），anti Collagen I（美國abcam；編號(hào)AB90395），anti PI3K，anti p?PI3K（Sigma 公司，美國），antiAkt（武漢Protec?tech；編號(hào)60203?2），anti?pAkt（美國Cell Signaling；編號(hào)4060），antimTOR（美國AbCam；編號(hào)AB32028），anti?HIF?1α，anti?GAPDH，antip?mTOR（美國AbCam公司），antiGapdh（武漢Protectech；編號(hào)10494?1），BEZ235 抑制劑（Selleck 美國CAS915019?65?7），Matrigel 膠（Affinity 美國），逆轉(zhuǎn)錄及PCR 反應(yīng)體系購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 IMECs 分離、培養(yǎng)在無菌條件下取健康大鼠部分空腸剪碎，加入消化液（37 ℃，0.25%胰蛋白酶）1 mL，在0.25%胰酶1 mL 滅菌離心管中消化5 min，用15%FBS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基5 mL 終止消化。4 ℃、3 000 r/min 離心8 min，棄上清，加完全培養(yǎng)基（15% FCS?F12、0.5 μg/mL 胰島素、1 μg/mL 氫化可的松、5 μg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、2 μmol/mL 谷氨酰胺）；得到的懸液在4 ℃條件下，再離心8 min 后，吸除上清液，加入8 mL 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打數(shù)次后，靜置1 min，吸取懸液，轉(zhuǎn)入0.1%明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)96 h 后局部的消化處理和培養(yǎng)72 h 后的差速黏附處理，得到純化內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)上述處理的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)傳代，取第三或四代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鼠富PLT血漿（PRP）和洗滌血小板（washed platelet，WP）制備及血小板的活化的檢測(cè)以上各組大鼠在麻醉處死前，腹主動(dòng)脈取血。WP 制備：將抗凝管中的全血輕輕混勻，室溫下離心，800 r/min 離心15 min，取上層PRP 再次室溫下離心，2 000 r/min 離心10 min，加入1 μmol/L 的前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）防止血小板活化，棄上層血漿，以PBS 緩沖液洗滌PLT 兩次，重新輕輕重懸于PBS 緩沖液或培養(yǎng)基中，制成血小板混合懸液，同時(shí)調(diào)整PLT 計(jì)數(shù)為2×108/mL［5］。

1.2.3 IMECs細(xì)胞的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)24孔板的Transwell 小室（8 μmol/L 聚碳酸脂膜），上室膜表面均勻鋪被去生長(zhǎng)因子的Matrigel 的DMEM 培養(yǎng)基稀釋液（1∶4，v/v）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置30 min 使之凝固，備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IMECs細(xì)胞懸液100 μL 接種于上室，低血清培養(yǎng)（0.5%，v/v），下室加入無血清DMEM培養(yǎng)基600 μL。每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。根據(jù)分組情況，加入活化血小板、PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 作用于IMECs 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后取出小室，棄去培養(yǎng)基，漂洗2 次，用鑷子取下濾膜置于載玻片上，于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 毛細(xì)血管管腔形成實(shí)驗(yàn)將基質(zhì)膠Matrigel（100 μL/ 孔）加入48 孔培養(yǎng)板實(shí)驗(yàn)孔，37 ℃培養(yǎng)箱 內(nèi) 溫 育30 min 凝 固 后，每 孔 加 入1 × 105個(gè)IMECs 細(xì)胞，細(xì)胞中分別加入活化血小板及PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235，共孵育12 h，對(duì)毛細(xì)血管管腔形成使用倒置顯微鏡觀察和拍照，并以Image J軟件對(duì)管腔形成長(zhǎng)度進(jìn)行定量分析。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，每孔選5 個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)IMECs 細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)刺激細(xì)胞作用結(jié)束時(shí)，加苯甲基磺酰氟（PMSF）+放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）細(xì)胞裂解液，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，上清液中的蛋白濃度以二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定。取等量蛋白與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min 后上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺（SDS?PAGE）凝膠電泳。電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用含5%脫脂奶粉和TBST 緩沖液（20 mmol/L Tris HCl，150 mmol/L NaCl 和0.05%Tween 20）封閉1 h，加入一抗E?cadherin（1∶5 000）定影。同法測(cè)定各組細(xì)胞中α?SMA、CollagenI 蛋白含量。

1.2.6 RT?PCR 法檢測(cè)IMECs 纖維化相關(guān)基因mRNA 水平的影響（1）提取細(xì)胞總RNA；（2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），95 ℃2 min（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）；（3）PCR 反應(yīng)：預(yù)變性：95 ℃10 s；PCR反應(yīng)：變性95 ℃5 s，退火/延伸60 ℃，30 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均做GAPDH 管作為內(nèi)標(biāo)。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RT? PCR 反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品梯度的測(cè)量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算各樣品所測(cè)基因含量，各樣品目的基因的含量除以其管家基因的含量，即得到樣品校正后的基因相對(duì)含量。E?cadherin 引物序列：上游5′?GCCAATCCTGATGAAATTGGAA?3′，下游5′?CAGAACCACTGCCCTCGTAATC?3′；α?SMA 引物序列：上游5′?ATAACATCAAGCCCAAATCTGC?3′，下游5′?TTCCTTTTTTCTTTCCCAACA?3′；colllagenⅠ引物序列：上游5′?TACAGCACGCTTGTGGATG?3′，下游5′?TTGGGATGGAGGGAGTTTA?3′；GAPDH 引物序列：上游5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3′，下游5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)≥3 次，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用配對(duì)t?test，多組間比較采用Oneway?ANOVA。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMECs 鑒定經(jīng)倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)特征鑒定95%以上為內(nèi)皮細(xì)胞特征，呈短梭形和多角形；免疫組織化學(xué)染色CD31 蛋白抗原陽性（圖1）。

圖1 IMECs 內(nèi)皮細(xì)胞鑒定CD31 蛋白抗原檢測(cè)（×400）Fig.1 CD31 protein antigen detection for IMECs endothelial cell identification（×400）

2.2 流式法檢測(cè)靜息及活化的血小板P?selectin抗體濃度加入終濃度為25 μmol/L 的血小板激動(dòng)劑二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）到上述血小板中［6］，溫箱中放置20 min 即為活化血小板。為了檢測(cè)血小板活化程度，以流式法分別檢測(cè)上述靜息及活化的血小板P?selectin 抗體濃度。血小板活化采用P?selectin 活化指標(biāo)檢測(cè)其含量［模型組：ADP 誘導(dǎo)（25 μmol/L）］，結(jié)果顯示，加入ADP 后P?selectin 抗體濃度明顯增高（P＜0.01），表明活化血小板數(shù)量明顯增加（圖2）。

圖2 流式法檢測(cè)靜息及活化的血小板P?selectin抗體濃度Fig.2 Flow cytometry for detection of resting and activated platelet P?Selectin antibody concentrations

2.3 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對(duì)血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞遷移能力的影響Platelets 誘導(dǎo)組細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加，而抑制劑處理組能顯著抑制platelets 誘導(dǎo)所致的細(xì)胞遷移的增加（P＜0.01，圖3）。

2.4 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對(duì)血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞管腔形成的影響Platelets 誘導(dǎo)組細(xì)胞小管形成能力明顯增強(qiáng)，而抑制劑處理組能顯著抑制platelets 誘導(dǎo)所致的管腔形成（P＜0.01，圖4）。

2.5 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235對(duì)血小板活化誘導(dǎo)的IMECs通路蛋白磷酸化及HIF?1α的影響應(yīng)用PI3K 抑制劑BEZ 處理后，再用活化的血小板上清誘導(dǎo)，PI3K/AKT/mTOR 蛋白無明顯變化（P＜0.05），而相關(guān)蛋白磷酸化水平明顯受到抑制，HIF?1α受抑制（P＜0.01，圖5）。

2.6 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對(duì)血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞的EMT 影響抑制劑BEZ235處理后，纖維化相關(guān)蛋白α?SMA、Collagen I 明顯受到抑制（P＜0.01），而E?cadherin 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01，圖6）。

圖3 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對(duì)血小板誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色×200）Fig.3 Effects of PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 on platelet?induced IMECs cell migration（crystal violet staining× 200）

圖4 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對(duì)血小板誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞管腔形成的影響（×200）Fig.4 Effects of PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 on platelet induced lumen formation of IMECs cells（×200）

圖5 加入BEZ235 后對(duì)通路蛋白磷酸化及HIF?1α的影響Fig.5 Effects of BEZ235 on phosphorylation of pathway proteins and HIF?1α

2.7 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對(duì)血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響B(tài)EZ235 處理后，加入platelets 誘導(dǎo)，RT?PCR 檢測(cè)纖維化指標(biāo)，結(jié)果如圖7 所示：platelets 誘導(dǎo)組纖維化相關(guān)基因（α?SMA，collagenⅠ）表達(dá)增加，而抑制劑處理組能顯著抑制platelets 誘導(dǎo)所致的纖維化基因表達(dá)的增加。同時(shí)E?cadherin 基因表達(dá)相反，模型組顯著降低，抑制劑處理后明顯增加。

圖6 加入BEZ235 后對(duì)細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effects of BEZ235 on EMT?related proteins in cells

3 討論

在本研究中，通過IMECs 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在CD 細(xì)胞模型中研究了IMECs 細(xì)胞的EMT 機(jī)制。正常人體內(nèi)血小板功能處于靜息狀態(tài)，而CD 患者腸道黏膜活檢可見毛細(xì)血管內(nèi)血小板的聚集，CD 患者活動(dòng)期時(shí)腸道免疫紊亂引起白細(xì)胞在局部腸粘膜組織的聚集，腸道局部及血漿中不同炎性因子的改變，通過破壞內(nèi)皮屏障功能，增加局部血管通透性，腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞的受到損傷，基底膜膠原蛋白暴露，刺激了血小板生成及活化，血小板在受損血管的聚集、粘附，使腸道微血管栓塞，導(dǎo)致缺血性損傷壞死；同時(shí)體內(nèi)血小板的聚集性增加，血液中纖維蛋白增多，粘滯性增高，患者體內(nèi)呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，微血栓形成，繼而腸道血流灌注量減少，腸黏膜細(xì)胞因缺血缺氧而變性，引起黏膜組織損傷，引發(fā)或加重炎癥、潰瘍、血管新生、纖維化修復(fù)等多種病理過程［7］。有研究表明，在炎癥性腸病發(fā)病過程中，血小板增多和活化能參與炎癥的起始過程，進(jìn)一步激活血管生成，與血栓、纖維化等形成相關(guān)［8］。血小板活化與CD 的腸纖維化聯(lián)系密切在臨床已經(jīng)得到證實(shí)，但其中現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)理的闡明，尚待研究。

圖7 加入BEZ235 后對(duì)細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of BEZ235 on the expression of EMT?related genes in cells

隨著血小板和血管生成研究的不斷深入，血小板在血管生成過程中的作用也逐漸得到了肯定。PINEDO 等［9］首先提出了血小板參與血管生成的證據(jù)，認(rèn)為血小板的活化與血管生成關(guān)系密切。在微血管生成的過程中，血小板可以釋放多種血管形成促進(jìn)因子如VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet?derived growth factor，PDGF）等（最主要是VEGF），經(jīng)旁分泌作用于內(nèi)皮細(xì)胞，從而啟動(dòng)并促進(jìn)血管生成過程，在血管生成早期階段的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］；在體外實(shí)驗(yàn)中，血小板能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管的管腔形成［11］。VEGF 受體中的VEGFR?2 直接參與血管生成，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和滲透；VEGF 家族中的VEGF?A 與VEGFR?2 結(jié)合是控制血管生成的關(guān)鍵途徑［12］。二者結(jié)合引起受體二聚化，從而激活下游包括PI3K/AKT/mTOR 在內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，共同支持內(nèi)皮細(xì)胞的生存和刺激其增殖，從而促進(jìn)血管生成，是VEGF 引起內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的主要信號(hào)通路［13］。PI3K/AKT 信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞生理活動(dòng)，在維持細(xì)胞的正常生理功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝等方面起著關(guān)鍵作用；mTOR 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的關(guān)鍵通路，對(duì)細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、代謝、血管新生以及細(xì)胞周期等進(jìn)行調(diào)控；前期血小板相關(guān)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)血小板活化釋放多種促血管生成因子作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）發(fā)生血管生成［14］。目前，血小板活化對(duì)腸纖維化作用的機(jī)制尚不明確，而病理性血管生成為闡明該機(jī)理提供了一個(gè)新的視角，對(duì)以病理性血管生成及血小板活化為靶標(biāo)的抗腸纖維化治療的探索至關(guān)重要。

纖維化的病理過程包括炎癥、缺氧、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等復(fù)雜過程［15］。研究顯示：CD 腸道病變的早期炎癥是纖維化過程的一個(gè)關(guān)鍵觸發(fā)因素，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為纖維化進(jìn)程的特征。EMT 在啟動(dòng)和維持腸纖維化中有重要作用［16］，EMT 作為生物體內(nèi)的一種生理病理現(xiàn)象，除了參與胚胎形成、發(fā)育及新生血管形成外，也參與體內(nèi)纖維化紊亂等過程。因此，對(duì)腸血管內(nèi)皮細(xì)胞的EMT 機(jī)制研究，也是研究腸纖維化的重要方向。在EMT 過程中，內(nèi)皮細(xì)胞不僅表型發(fā)生明顯變化，相關(guān)標(biāo)記物也同樣發(fā)生了變化：內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如E?cadherin 表達(dá)量下降；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，如α?SMA 等表達(dá)上調(diào)。此外，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力明顯增強(qiáng)。

過度和異常的血管生成作為組織異常修復(fù)的中心環(huán)節(jié)越來越多地引起關(guān)注。缺氧是導(dǎo)致血管生成的最主要刺激因素，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)核心轉(zhuǎn)錄因子HIF?lα。幾乎所有的促血管生成因子的表達(dá)都是由HIF?lα的轉(zhuǎn)錄活性改變而受到調(diào)控，如VEGF、PDGF 等，這些因子參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控血管生成過程［17］；而缺氧亦為導(dǎo)致器官纖維化的機(jī)制之一，HIF?lα誘導(dǎo)的EMT 通過一定的途徑調(diào)控器官纖維化的形成和發(fā)展［18］，如HIF?lα能夠通過Snail 和β?catenin 信號(hào)通路調(diào)控endoEMT 從而干預(yù)早期肺纖維化的進(jìn)程［19］。PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，被認(rèn)為是HIF?lα主要的上游調(diào)節(jié)通路之一［20］，而從上文可以看出其亦為VEGF 介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的主要通路。HIF?lα為從血管生成到纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵樞紐性因子，而PI3K/AKT/mTOR通路為從血小板活化到血管生成最終形成纖維化這一進(jìn)程中的關(guān)鍵信號(hào)通路。

最近的研究發(fā)現(xiàn)血管生成與纖維化密切相關(guān)［21-23］。VEGF 的高表達(dá)在血管生成發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［24-26］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)足量的活化的血小板可以刺激IMECs 的血管生成。此外，本研究還初步闡釋了相關(guān)的作用機(jī)制和信號(hào)通路。本研究評(píng)價(jià)了VEGF 的相對(duì)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VEGFR組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示VEGF 與VEGFR 表達(dá)無相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示加入PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235前后比較，活化的血小板刺激增強(qiáng)了IMECs的細(xì)胞遷移能力、管腔形成的能力，對(duì)PI3K、AKT、mTOR 磷酸化蛋白及HIF?1α蛋白起到抑制作用，纖維化相關(guān)因子α?SMA、Collagen I 的蛋白生成及基因表達(dá)明顯受到抑制，而E?cadherin 蛋白生成及基因表達(dá)則上調(diào)。表明活化血小板誘導(dǎo)的IMECs細(xì)胞的EMT 是通過PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路影響血管生成實(shí)現(xiàn)的。