熊瓔珞 楊波 陳建文 薛琦 方海洲 張革

1中山大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)系（廣州510006）；2珠海億勝生物制藥有限公司研發(fā)中心（廣東珠海519085）；3中山大學(xué)藥學(xué)院（廣州510006）；4億勝生物科技（中國(guó)香港999077）

腎上腺皮質(zhì)激素，發(fā)揮著抑制炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的重要功能，被廣泛應(yīng)用于慢性濕疹、銀屑病等疾病的治療［1］。臨床上長(zhǎng)期接觸激素反而造成皮膚局部萎縮甚至皸裂等副作用［2］，但其具體機(jī)制仍有待闡明。FEINGOLD 研究組和李遠(yuǎn)宏主任醫(yī)師分別通過(guò)在無(wú)毛小鼠上涂抹氯倍他索后行膠帶剝離操作和在豚鼠皮膚中反復(fù)涂抹丙酸氯倍他索，造成短期和長(zhǎng)期接觸激素誘導(dǎo)的皮損和角化不全［3-4］，有效的模擬了臨床上激素長(zhǎng)期接觸導(dǎo)致的皮膚局部損傷和功能失調(diào)的表型。目前激素依賴導(dǎo)致的皮損皮炎治療遵循戒斷激素、加強(qiáng)護(hù)理、綜合治療的原則來(lái)對(duì)患者進(jìn)行臨床干預(yù)和觀察［5］。鈣調(diào)神經(jīng)酶抑制劑他克莫司可通過(guò)抑制炎癥迅速緩解激素依賴性皮炎的干燥緊繃感［6］。聶元梅等用藍(lán)膚科寧護(hù)膚品治療激素依賴性皮炎發(fā)現(xiàn)治療后患者癥狀體征評(píng)分明顯低于治療前及對(duì)照組［7］。近年來(lái)越來(lái)越多的臨床研究關(guān)注生長(zhǎng)因子類藥物在激素依賴性皮炎緩解中的療效［8］。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可廣譜性的促進(jìn)外胚層和中胚層來(lái)源的細(xì)胞的增殖、遷移和分化，具有促進(jìn)組織修復(fù)、骨骼發(fā)育和維持代謝穩(wěn)態(tài)等重要的生理作用［9］，已成為皮膚創(chuàng)傷、潰瘍和組織修復(fù)的重要候選藥物［10］。然而，bFGF 在長(zhǎng)期激素接觸導(dǎo)致的皮損和皮炎副作用中的功能尚未被闡明，深入研究bFGF 在其中的修復(fù)作用和機(jī)制，具有強(qiáng)大的理論科研價(jià)值和應(yīng)用前景。

本文在氯倍他索誘導(dǎo)的小鼠皮損模型上使用bFGF 凝膠干預(yù)，研究其對(duì)治療組小鼠表皮失水率和壞死、皮膚炎性浸潤(rùn)的影響，且體外鑒定氯倍他索對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25% 胰蛋白酶?EDTA 溶液（Gibco），100×青霉素?鏈霉素溶液、溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）、丙二醇溶液、5×蛋白上樣緩沖液、ECL 超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自生工生物工程有限公司，RIPA 細(xì)胞裂解液（Thermo Fisher），anti?Claudin 1 抗體（Cell Signaling Technology），anti?Claudin 2 抗 體（Lifespan Biosci?ences），anti?GAPDH 抗體（Proteintech），丙酸氯倍他索（Sigma），bFGF 重組蛋白由珠海億勝生物制藥有限公司通過(guò)基因重組技術(shù)由大腸桿菌發(fā)酵后獲得，與卡波姆、甘油和羥苯乙酯輔料一起制備為凝膠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及造模SPF 級(jí)6 ～8 周齡的C57BL/6J 雌鼠購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房?jī)?nèi)，給藥及造模均于屏障內(nèi)進(jìn)行。將小鼠背部剃毛暴露2 cm × 2 cm 面積的皮膚，按7 只每組分為3 組：一組為溶媒對(duì)照涂抹溶解氯倍他索的試劑丙二醇∶乙醇7∶3（體積比）；一組為造模組涂抹0.05%的氯倍他索溶液，每天給藥2 次，持續(xù)7 d；一組為造模并給予bFGF 外用凝膠干預(yù)組，在每次涂抹完氯倍他索溶液30 min 后，涂抹含bFGF 20 μg/g gel 的外用凝膠（同時(shí)前兩組涂抹同樣體積的空輔凝膠，即包含卡波姆、甘油和羥苯乙酯的凝膠）。最后一次給藥后24 h，使用無(wú)菌敷貼在給藥部位進(jìn)行膠帶剝離操作4 次，并在膠帶剝離完成時(shí)和12 h 后拍照記錄背部皮膚外觀。

1.3 小鼠表皮水分流失測(cè)定在膠帶剝離術(shù)后12 h 固定小鼠，將手持VapoMeter 皮膚水分測(cè)定儀緊貼于小鼠背部皮膚，讀取經(jīng)表皮水分流失（trans epidermal water loss，TEWL）讀數(shù)，連續(xù)測(cè)量?jī)纱危∑骄怠?/p>

1.4 小鼠皮膚組織H&E 染色及病理分析皮膚組織經(jīng)多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋切片，按文獻(xiàn)中方法行H&E 染色［11］。在ZEISS Axiocam ERc 5s 高倍（200 ×）光學(xué)顯微鏡下行切片拍照，并分析組織內(nèi)表皮脫落和組織炎性浸潤(rùn)情況。認(rèn)定核質(zhì)固縮的細(xì)胞為死細(xì)胞，鑒定多型分裂核、胞質(zhì)淺染的細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，同時(shí)對(duì)具有明顯血管腔壁和紅細(xì)胞的血管進(jìn)行多視野計(jì)數(shù)。

1.5 人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT的體外培養(yǎng)永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物與化學(xué)研究所，將HaCaT重懸于含有10%FBS和1% 青霉素?鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)。每隔2 天換一次液，待細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度90%以上時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶?EDTA 溶液消化后，按1∶5 的比例進(jìn)行傳代，約3 ～4 d 傳代一次，取第3 ～7 代細(xì)胞開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 氯倍他索體外刺激后細(xì)胞活力及緊密連接蛋白檢測(cè)將HaCaT 按1 × 104/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜至貼壁狀態(tài)后，更換含0.2%FBS的條件培養(yǎng)液，血清饑餓過(guò)夜。向培養(yǎng)體系中加入氯倍他索溶液至工作濃度分別為20、40、60、80 μg/mL（對(duì)照組給予等體積的DMSO），將孔板置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)72 h。然后向培養(yǎng)體系中加入MTT 溶液至終濃度為5 mg/mL，繼續(xù)孵育4 h 后棄去培養(yǎng)液，向孔板中加入DMSO：無(wú)水乙醇體積比1∶1 配置的細(xì)胞裂解液（120 μL/孔），振蕩10 min 后于Molecular Devices 多功能酶標(biāo)儀上記錄570 nm 和630 nm 處的吸光值，計(jì)算給藥組相對(duì)對(duì)照組的細(xì)胞活力（%）?；?qū)aCaT 按2×105/孔的密度接種于12 孔板中，培養(yǎng)和給藥方法一致，氯倍他索刺激24 h 后使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western blotting 方法［12］檢測(cè)緊密連接蛋白Claudin 1，Claudin 2 的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在GraphPad Prism 5 軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)數(shù)據(jù)以形式表示，采用One?way ANOVA 方法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 bFGF 凝膠干預(yù)顯著減緩氯倍他索涂抹聯(lián)合膠帶剝離造成的小鼠背部皮損處死小鼠前拍照記錄小鼠背部皮膚外觀可發(fā)現(xiàn)，造模組的小鼠皮膚在膠帶剝離完成時(shí)和12 h 后均存在嚴(yán)重皮損，表現(xiàn)為表皮發(fā)紅、水腫且存在明顯外傷未愈合（圖1B，1D），而涂抹溶媒的對(duì)照組小鼠皮膚只在膠帶剝離剛完成時(shí)可見(jiàn)表皮輕微紅腫，12 h 后基本恢復(fù)正常（圖1A，1C）。給予了bFGF 外用凝膠的小鼠在膠帶剝離完成時(shí)皮膚紅腫程度顯著弱于單獨(dú)氯倍他索造模的小鼠（圖1B，1C），12 h 后皮損面積也明顯減小（圖1E，1F）。

圖1 膠帶剝離完成時(shí)與膠帶剝離操作12 h 后小鼠背部皮膚照片F(xiàn)ig.1 Back photos of mice just after tape?stripping and 12 hours post tape?stripping

2.2 bFGF凝膠干預(yù)顯著降低氯倍他索反復(fù)涂抹聯(lián)合膠帶剝離增加的表皮失水率膠帶剝離完成12 h后檢測(cè)小鼠背部表皮水分流失，發(fā)現(xiàn)給予了氯倍他索的造模組小鼠表皮失水率（38.83 ± 1.85 g/m2h）顯著高于溶媒對(duì)照小鼠（16.93±0.79 g/m2h），而涂抹了bFGF 凝膠后小鼠背部表皮失水率（31.12 ±1.77 g/m2h）明顯降低（表1），但仍高于溶媒對(duì)照組（圖2）。

2.3 bFGF凝膠干預(yù)顯著減少造模組表皮細(xì)胞壞死和皮膚炎性浸潤(rùn)小鼠皮膚組織H&E 染色顯示，溶媒對(duì)照組表皮層結(jié)構(gòu)完整，鱗狀上皮細(xì)胞形態(tài)正常、排列緊密；真皮層膠原纖維豐富、排列規(guī)則（圖3A）。造模組可見(jiàn)大量表皮層細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞體積減小（黑色箭頭），大面積真皮層細(xì)胞壞死，核碎裂（黃色箭頭），伴有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（藍(lán)色箭頭、圖3B）。涂抹bFGF 凝膠干預(yù)后小鼠的表皮層細(xì)胞核固縮和真皮層細(xì)胞壞死狀況得到明顯改善，同時(shí)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)減少（圖3C）。

表1 膠帶剝離12 h 后小鼠表皮失水率測(cè)定Tab.1 Detection of trans epidermal water loss at 12 hours post tape?stripping

圖2 膠帶剝離12 h 后小鼠表皮失水率測(cè)定Fig.2 Detection of trans?epidermal water loss at 12 hours post tape?stripping

2.4 bFGF 凝膠干預(yù)改善造模組皮下組織出血小鼠皮膚組織H&E 染色顯示，氯倍他索造模組小鼠皮下組織局部可見(jiàn)輕度出血和血管數(shù)目增加（圖3 B 紅色箭頭），高倍鏡視野下進(jìn)行血管計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)造模發(fā)生皮損后小鼠皮下組織血管生成數(shù)目相比溶媒組小鼠急劇增多，而bFGF 凝膠干預(yù)組小鼠血管數(shù)目明顯減少（圖4）。

3 討論

本研究中的激素涂抹聯(lián)合膠帶剝離改良造模方法可造成小鼠皮膚損傷，此表型有效的模擬了臨床上激素依賴導(dǎo)致的皮損和皮炎副作用。而給予bFGF 凝膠干預(yù)可有效減弱皮損，表現(xiàn)為表皮失水率的減少，表皮層細(xì)胞大量壞死和出血情況的改善。本研究采樣時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到造模組皮損程度和表皮失水率仍顯著高于溶媒組，但bFGF 凝膠干預(yù)組外傷已基本愈合，提示bFGF 加速了表皮組織屏障功能的修復(fù)。在FEINGOLD［13］的研究中，單獨(dú)膠帶剝離實(shí)驗(yàn)可誘導(dǎo)IL?1α，IL?1β，IL?6，TNF?α，GM?CSF 等炎癥因子表達(dá)的上調(diào)，同時(shí)伴隨中性粒細(xì)胞向組織局部聚集。此外，持續(xù)的bFGF 刺激可以下調(diào)炎癥因子IL?1 或TNF?α誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞內(nèi)皮粘附和經(jīng)內(nèi)皮遷移［14］。本研究中使用bFGF干預(yù)凝膠檢測(cè)到皮損局部中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)較單獨(dú)使用激素組明顯降低，提示皮膚損傷恢復(fù)期bFGF 可介導(dǎo)局部炎癥應(yīng)答減弱，該內(nèi)容需要進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 各組小鼠皮膚組織H&E 染色（200×）Fig.3 H&E staining of skin tissue of mice in each group（200×）

圖4 高倍鏡（200×）下小鼠皮下組織血管計(jì)數(shù)Fig.4 Vascular counting in mouse subcutaneous tissue in high magnification（200×）

此外，本研究發(fā)現(xiàn)bFGF 凝膠干預(yù)后小鼠皮膚的出血情況得到改善，真皮組織和皮下組織區(qū)血管數(shù)目顯著減少。隨著bFGF 對(duì)于新生血管作用研究的加深，bFGF 已從一種簡(jiǎn)單的促血管生成細(xì)胞因子［15］，逐漸被發(fā)現(xiàn)為在微環(huán)境中參與血管重塑的因子［16］，持續(xù)的bFGF 釋放還可能通過(guò)抑制內(nèi)皮的活化和免疫細(xì)胞的募集從而調(diào)控炎癥［14］。本文誘導(dǎo)的皮損模型中發(fā)現(xiàn)，血管數(shù)目的增加與組織損傷和炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，而與bFGF 凝膠無(wú)直接關(guān)聯(lián)。

圖5 不同濃度氯倍他索刺激的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 細(xì)胞活力測(cè)定和緊密連接蛋白水平測(cè)定（200×）Fig.5 Determination of HaCaT cell viability and tight junction protein in human keratinocytes stimulated by different concentrations of clobetasol（200×）

長(zhǎng)期接觸氯倍他索會(huì)造成皮膚局部萎縮甚至皸裂等副作用［17］，但其中的細(xì)胞分子機(jī)制尚不明確。VIENNET 組鑒定了不同種類和濃度的腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 的增殖抑制作用［18］，F(xiàn)EINGOLD 發(fā)現(xiàn)［3］短期反復(fù)涂抹氯倍他索的小鼠皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)前體合成顯著減少，從而使表皮通透性增強(qiáng)。而Claudin 蛋白作為主要表達(dá)于表皮層中的重要的緊密連接蛋白家族，形成細(xì)胞間的緊密連接并調(diào)節(jié)各類小分子的跨表皮內(nèi)外滲透［19］，因此檢測(cè)其在激素接觸條件下的細(xì)胞和組織水平，對(duì)鑒定表皮的通透性具有重要指示意義。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了氯倍他索對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)開(kāi)創(chuàng)性的通過(guò)免疫印跡法鑒定發(fā)現(xiàn)氯倍他索下調(diào)Claudin 1 和Claudin 2蛋白的表達(dá)（圖5），對(duì)后續(xù)研究氯倍他索等糖皮質(zhì)激素造成的皮膚不良反應(yīng)研究提供了新的思路。

總之，bFGF 凝膠有效的保護(hù)和緩解了激素反復(fù)接觸聯(lián)合機(jī)械外力造成的實(shí)驗(yàn)性小鼠皮損，為以外源性bFGF 為活性成分的藥物應(yīng)用于臨床上激素依賴性皮損皮炎的治療提供了一定的理論支撐和研發(fā)思路。