成彥，凌春瑩，羅亞鴿，陳寶龍，孫瑞

河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）生化研究室，河南洛陽 471000

免疫蛋白酶體是一種具有多相催化活性的蛋白酶復(fù)合體，它廣泛存在于血源性細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中， 并直接參與了免疫系統(tǒng)的運(yùn)作，在抗原呈遞、免疫應(yīng)答等過程中扮演關(guān)鍵角色[1-4]。 免疫蛋白酶體亞基LMP7 在多種自身免疫性疾病中被認(rèn)定為重要的自身抗原，針對(duì)它們的自身免疫反應(yīng)可能與炎癥反應(yīng)相關(guān)[5]。 免疫蛋白酶體促進(jìn)Th 細(xì)胞分化，RA 細(xì)胞模型中，LMP7 受抑制可導(dǎo)致90% IL-23 的產(chǎn)生受抑制， 及 50% TNF-α 和 IL-6 受抑制； 抑制LMP7 活性，可緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型病情[6]，提示LMP7 與RA 存在一定聯(lián)系，其表達(dá)、活性極有可能參與了RA 的發(fā)生、發(fā)展，但目前此方面研究較少。

迄今，有關(guān)人PBMC 中LMP7 酶活力的測(cè)定方法尚未見報(bào)道。 該研究擬在熒光法的基礎(chǔ)上，采用單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)LMP7 活性測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化， 確定人PBMC 中LMP7 酶活力測(cè)定的最優(yōu)化條件， 以LMP7酶活力為依據(jù)，為進(jìn)一步探究其在RA 發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

熒 光 多 肽 底 物 Ac-ANW-AMC、DMSO、Ficoll-Paque、無菌 PBS pH 7.2～7.4，其它試劑為分析純。

底物溶液配制： 熒光多肽底物Ac-ANW-AMC，底物原包裝2 mg，輕微離心，加入169.8 μL DMSO 制成20 mM 底物母液，分裝并儲(chǔ)存于-20℃。 使用時(shí)，用DMSO 稀釋為2 mM 工作液。

反應(yīng)緩沖液：pH 8.0 Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10%，SDS 0.01% (w/v)[11]。

1.2 儀器

多功能酶標(biāo)儀（Spectramax i3x MD）；高速冷凍離心機(jī) （5804R Eppendorf）； 分析天平 （XS205 METTLER-TOLEDO）；pH 儀（S220 METTLER-TOLEDO）；超純水儀（EASYPure II Barnstead）；超凈工作臺(tái)（SWCJ-1FD 蘇州安泰）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC 分離 依照單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案。取健康受試者或RA 患者空腹外周靜脈血3 mL，肝素抗凝。超凈臺(tái)中進(jìn)行細(xì)胞分離。3 mL 外周血加入等體積常溫 PBS（pH 7.2～7.4）緩沖液稀釋，15 mL 離心管事先加入3 mL Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液， 傾斜離心管，緩慢小心地將混合均勻的PBS 和全血混合液加入分離液上層，20℃，400 g，快加速慢減速，離心 20 min；小心移出離心管，應(yīng)可見4 層分離。上層血清，云霧層PBMC，中層 Ficoll， 下層為血漿。 使用 1 000 μL 移液槍，盡可能吸取云霧層，移入另一支15 mL 離心管，加入 10 mL 冷 PBS 充分洗滌，20℃，100 g，離心 10 min；棄上清， 輕彈試管， 加入10 mL 冷PBS 重懸細(xì)胞，20℃，100 g，離心 10 min，棄上清，加入 500 μl 反應(yīng)緩沖液，重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 細(xì)胞凍存及裂解 用反應(yīng)緩沖液調(diào)整PBMC 細(xì)胞懸液濃度至 5×106個(gè)/mL，按每管 100 μl 細(xì)胞懸液進(jìn)行分裝，置于液氮中冷凍。

1.3.3 LMP7 酶活力檢測(cè) 利用多肽熒光底物Ac-ANW-AMC， 通過檢測(cè) 37℃下，30 min 內(nèi)多肽底物的水解速度，即熒光產(chǎn)物AMC 的產(chǎn)生速度Vmax，檢測(cè)免疫蛋白酶體亞基LMP7 的活性。

冷水浴解凍細(xì)胞懸液， 用冰反應(yīng)緩沖液稀釋PBMC 細(xì)胞懸液至一定濃度，置于冰上待測(cè)。 在96 孔板的一個(gè)孔內(nèi)加入99 μl 稀釋的PBMC 細(xì)胞懸液，加入 1 μl 稀釋的 Ac-ANW-AMC 底物液，37℃避光孵育10 min， 啟動(dòng)反應(yīng)。 Spectramax i3x 酶標(biāo)儀設(shè)定為37℃，發(fā)射波長(zhǎng)λex=360 nm，激發(fā)波長(zhǎng)λem=460 nm，動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)30 min，使用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程描述熒光強(qiáng)度的變化值與時(shí)間之間的關(guān)系曲線[7]，記錄最大反應(yīng)速度Vmax（單位U）及線性判定系數(shù)R2。

1.3..4 PBMC 細(xì)胞濃度（LMP7 酶濃度）優(yōu)化

參照前期RA 患者PBMC 中LMP7 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，及已有LMP7 in vitro 活力檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道[7]，選擇設(shè)定 PBMC 細(xì)胞濃度為 1 000 個(gè)/μl，500 個(gè)/μl，250 個(gè)/μl 以及 125 個(gè)/μL。 每個(gè)處理設(shè)置平行實(shí)驗(yàn) 3次，包含健康受試者1 例，RA 患者2 例，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

1.3.5 細(xì)胞凍融循環(huán)次數(shù)優(yōu)化 免疫蛋白酶體極不穩(wěn)定，其活性對(duì)機(jī)械方法及Triton 等化學(xué)試劑特別敏感[8]，凍融裂解可能是裂解的首選方法。將PBMC 細(xì)胞懸液在液氮中冷凍10 min 后，冷水浴中解凍細(xì)胞懸液，設(shè)為一個(gè)凍融循環(huán)。 為進(jìn)一步優(yōu)化裂解效果，將同一樣品分別進(jìn)行1～5 次凍融后，檢測(cè)LMP7 酶活力。

1.3.6 細(xì)胞凍存時(shí)間對(duì)酶活力的影響 PBMC 在液氮中冷凍 10 min，3 h，1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 及 28 d后，冷水浴解凍，檢測(cè)LMP7 活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

該次研究采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，R2為紅性相關(guān)的判定系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 LMP7 酶濃度的優(yōu)化

分別考察不同細(xì)胞濃度（酶濃度）下，Vmax 以及R2的變化， 檢測(cè)結(jié)果見表 1。 在 3 個(gè)樣本中， 不同PMBC 細(xì)胞濃度（酶濃度）組均表現(xiàn)出一定LMP7 酶活力，但不同樣本、不同PBMC 細(xì)胞濃度下，LMP7 酶活力差異較大。

圖1 PBMC 細(xì)胞濃度對(duì)LMP7 酶活力檢測(cè)的影響

3 個(gè)樣品中，酶活力與酶濃度（細(xì)胞濃度）均呈正相關(guān)。 其中健康受試者PBMC（樣品3）中LMP7 酶活力低于 RA 患者（樣品 1，樣品 2）。 樣品 1，樣品 2 中，當(dāng) PBMC 細(xì)胞濃度＞250 個(gè)/μl 時(shí)， 線性相關(guān)系數(shù) R2＞0.95，見圖1（a），顯示該體系較好地符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程 Vmax=K3[E]，當(dāng) PBMC 細(xì)胞濃度為 125 個(gè)/μL時(shí)，R2＜0.95，與一級(jí)反應(yīng)相關(guān)性較差，見圖 1（b）。健康受試者即樣品 3 中， 當(dāng) PBMC 細(xì)胞濃度≥500 個(gè)/μL時(shí)，線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.95，顯示該體系較好地符合一級(jí)反應(yīng)， 當(dāng) PBMC 細(xì)胞濃度為≤250 個(gè)/μL 時(shí)，R2＜0.95，與一級(jí)反應(yīng)相關(guān)性較差。 為同時(shí)滿足對(duì)健康受試者及 RA 患者 PBMC 中 LMP7 酶活力的檢測(cè)，PBMC 細(xì)胞濃度應(yīng)≥500 個(gè)/μL。

表1 PBMC 細(xì)胞濃度對(duì)LMP7 酶活力的影響

2.2 細(xì)胞凍融循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

考察PBMC 細(xì)胞裂解時(shí)凍融循環(huán)次數(shù)對(duì)LMP7酶活力檢測(cè)結(jié)果的影響，見圖2。

結(jié)果表明，細(xì)胞冷凍循環(huán)次數(shù)對(duì)LMP7 酶活力檢測(cè)有較大影響。 一次凍融即可充分裂解細(xì)胞，滿足對(duì)PBMC 中 LMP7 酶活力的檢測(cè)。 當(dāng) PBMC 細(xì)胞裂解凍融循環(huán)為1～2 次時(shí)，LMP7 酶活力不受凍融循環(huán)次數(shù)影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，LMP7 酶活力逐漸降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，凍融循環(huán)對(duì)LMP7 酶活力具有破壞作用，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。因此，在滿足實(shí)驗(yàn)要求的前提下，為了進(jìn)一步保護(hù)LMP7 酶活力及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，選擇對(duì)PBMC 細(xì)胞進(jìn)行一次凍融以達(dá)到裂解細(xì)胞的目的。

圖2 不同凍融循環(huán)次數(shù)下LMP7 的酶活力

2.3 PBMC 細(xì)胞凍存時(shí)間對(duì)LMP7 酶活力的影響

PBMC 細(xì)胞在液氮凍存不同時(shí)間之后的LMP7 酶活力，見圖3。 結(jié)果表明，在使用液氮凍存細(xì)胞10 min到21 d 內(nèi)，LMP7 酶活力無顯著改變， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 PBMC 細(xì)胞凍存 14 d 時(shí)，LMP7 酶活力較7 d 時(shí)略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.060)。 28 d時(shí)，LMP7 酶活力進(jìn)一步減弱，較 1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 均有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見，使用液氮凍存PBMC 細(xì)胞， 可較好的保護(hù)LMP7 的酶活力，短時(shí)間凍存（＜21 d）對(duì) LMP7 酶活力影響較小。 為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)盡量縮短凍存時(shí)間（不超過21 d，7 d 內(nèi)最佳）， 在PBMC 細(xì)胞提取、 冷凍后及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

圖3 PBMC 細(xì)胞凍存時(shí)間對(duì)LMP7 酶活力的影響

3 討論

酶活力指酶的催化活性，用規(guī)定反應(yīng)條件下單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來表示。當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度時(shí)，Vmax 與酶的濃度成正比。該研究利用多肽熒光底物Ac-ANW-AMC，采用動(dòng)態(tài)法，連續(xù)檢測(cè)并計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)熒光產(chǎn)物AMC 的產(chǎn)生速度Vmax 來考察LMP7 酶活力。

饒文兵等通過極差分析得出酶濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響最顯著[9-10]。 Koroleva ON 等[7]得出 LMP7 酶活性 in vitro 測(cè)定的最優(yōu)化條件為：37℃，pH 8.0 的Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10% ，SDS 0.01% (w/v)緩沖液，酶濃度0.2 nM，底物濃度20 μM。根據(jù)前期 Western blotting 實(shí)驗(yàn)， 每 106 個(gè) PBMC 中LMP7（MW=27 kDa）含量約為 23～75 ng，該研究使用100 μlPBMC 細(xì)胞， 實(shí)驗(yàn)濃度區(qū)間為 125～1 000 個(gè)/μl。研究結(jié)果顯示不同PBMC 細(xì)胞濃度即酶濃度下，LMP7 酶活力差異顯著， 無論是健康受試者還是RA患者，當(dāng) PBMC 細(xì)胞濃度達(dá)到 500 個(gè)/μl 以上時(shí)，線性判定系數(shù)R2均＞0.95，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程Vmax=k3[E]，能夠更準(zhǔn)確地反應(yīng)酶活力。

Villoutreix BO 等[8]指出免疫蛋白酶體活性部位較不穩(wěn)定，其活性受溫度、pH 及例如Triton-100 等化學(xué)物質(zhì)影響， 即使-80℃低溫凍存其活性依然會(huì)隨時(shí)間降低。 根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[11]，該研究采用相對(duì)溫和的反復(fù)凍融法以釋放細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。使用液氮提高凍融速率，并在凍存時(shí)將PBMC 細(xì)胞懸液濃度提高為 5×106個(gè)/mL， 以盡可能地保護(hù)細(xì)胞及 LMP7 的酶活力。 為進(jìn)一步優(yōu)化裂解效果，對(duì)細(xì)胞冷凍保存時(shí)間和反復(fù)凍融法裂解對(duì)LMP7 酶活力的影響進(jìn)行考察。研究結(jié)果表明經(jīng)過3 次以上的凍融和21 d 以上的凍存對(duì)LMP7 酶活力的影響大，應(yīng)在細(xì)胞提取后使用液氮凍融1 次后及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是一種高效、 特異的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，是真核細(xì)胞中非溶酶體通路蛋白質(zhì)降解的主要途徑。 通過降解細(xì)胞內(nèi)無用的、合成錯(cuò)誤或受損的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，也因此參與調(diào)控生物體內(nèi)幾乎所有生命活動(dòng)：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長(zhǎng)周期、細(xì)胞分化和凋亡、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等[3]。

蛋白酶體26S 中的3 種β 亞基具有蛋白水解活性：β1（酸后水解活性）、β2（類胰蛋白酶活性）和 β5(類糜蛋白酶活性)在血源性細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中，蛋白酶體包含活性部位的3 個(gè)亞基分別被LMP2（β1i）、MECL1（β2i）和 LMP7（β5i）替代，組成免疫蛋白酶體，其底物特異性發(fā)生了變化。 免疫蛋白酶體亞基直接參與了抗體呈遞等免疫系統(tǒng)的運(yùn)作，并在其中扮演關(guān)鍵角色[2-4]。

LMP7 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[12]。 PR-957 是免疫蛋白酶體的共價(jià)性抑制劑，它選擇性地抑制免疫蛋白酶體亞基LMP7。 使用PR-957 處理RA 細(xì)胞模型可抑制IL-23、TNF-α 和 IL-6 等細(xì)胞因子的表達(dá)。 使用 PR-957 處理CAIA 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型， 首次用藥24 h 后即可觀察到病情緩解，用藥7 d 后IL-1β、IL-6等炎性因子顯著降低，小鼠跗骨關(guān)節(jié)炎癥侵蝕和持續(xù)性的骨質(zhì)溶解顯著降低[6]。揭示免疫蛋白酶體與RA 存在一定聯(lián)系，其表達(dá)、活性極有可能參與了RA 的發(fā)生、發(fā)展。該研究也證實(shí)，免疫蛋白酶體亞基LMP7 無論在健康人還是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的PBMC 中均有分布，且具有一定活性。RA 患者PBMC 中LMP7 活性高于健康受試者。通過大樣本量研究對(duì)比健康人與RA 患者PBMC 中LMP7 的表達(dá)及活性， 有助于進(jìn)一步研究LMP7 在RA 發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，為抑制免疫蛋白酶體治療自身免疫性疾病提供科學(xué)依據(jù)。

該研究發(fā)現(xiàn)樣本中健康受試者LMP7 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RA 患者，提示LMP7 與RA 存在明顯相關(guān)性。但由于樣本量小， 不同個(gè)體樣本中LMP7 活性差異較大，為了得到準(zhǔn)確的結(jié)論，仍需繼續(xù)進(jìn)行大樣本采集檢測(cè)分析。

該研究確定了LMP7 酶活力檢測(cè)的最優(yōu)條件，提供了一套簡(jiǎn)便、實(shí)用、可靠的LMP7 酶活力檢測(cè)方法，對(duì)RA 等免疫性疾病中LMP7 酶的后續(xù)研究有重要意義。