祝淵 陳松 王一鵬 楊文超 陳冬冬

人工發(fā)光二極管(LED)光源已被廣泛應(yīng)用到人們的日常生活及工作中，視網(wǎng)膜是否能長(zhǎng)期耐受已引起視覺(jué)工作者的密切關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[1]，光線因波長(zhǎng)及強(qiáng)度的差異對(duì)視網(wǎng)膜組織代謝產(chǎn)生的影響也不相同，并檢測(cè)到光損傷視網(wǎng)膜中自由基含量明顯升高,繼而引發(fā)視網(wǎng)膜視錐視桿細(xì)胞內(nèi)外盤節(jié)的功能異常，造成視網(wǎng)膜視覺(jué)循環(huán)中間產(chǎn)物的異常堆積，最終引起視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡。還有研究還指出，視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷可能與老年性黃斑變性發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2-3]。因此，研究視網(wǎng)膜光損傷并探索有效的預(yù)防措施對(duì)于防治相關(guān)疾病具有重要意義。本研究觀察不同波長(zhǎng)LED光源在不同光照強(qiáng)度(照度)條件下對(duì)大鼠視網(wǎng)膜的損傷情況，為不同波長(zhǎng)的LED光源使用的安全照度和時(shí)間提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源3周齡雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量75～100 g，均購(gòu)于北京維通利華公司。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠在動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，給予相同標(biāo)準(zhǔn)食物及水量，室溫25 ℃左右，除實(shí)驗(yàn)特殊光照外，余光照均為日常自然光。本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠的使用符合《眼科和視覺(jué)研究中使用動(dòng)物的聲明》(ARVO 2013年)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)從蘇州晶致醫(yī)療科技有限公司定制了光源為單波長(zhǎng)紅色LED(620 nm±10 nm)、綠色LED(520 nm±10 nm)、藍(lán)色LED(460 nm±10 nm)和白色LED燈光(三色融合，色溫3000 K)。每個(gè)光源獨(dú)立開(kāi)關(guān)控制，并可調(diào)節(jié)亮度。照度測(cè)量計(jì)確保同組大鼠受光照度暴露相同。光學(xué)手術(shù)顯微鏡(蔡司，德國(guó))，石蠟切片機(jī)(萊卡，德國(guó))；PARP抗體(1500～12000)、GFAP抗體(1500～12000)、β-actin抗體(13000～110 000)(Affinity，美國(guó))，羊抗兔抗體(13000～110 000)、100 g·L-1預(yù)制膠、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL顯色試劑盒、磷酸化蛋白提取試劑盒(Solarbio，北京)；TUNEL凋亡染色試劑盒(碧云天，上海)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組SD大鼠共45只，其中5只大鼠全程自然光下飼養(yǎng)作為空白對(duì)照組，其余按1000 lux照度和2000 lux照度分為兩個(gè)大組，兩組再根據(jù)接受光照不同分為紅光照射組、綠光照射組、藍(lán)光照射組和白光照射組(每組5只大鼠)，各光照組大鼠每天用相應(yīng)波段光照射10 min，其余時(shí)間自然光下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前大鼠置于黑暗環(huán)境中2周，以清除光暴露實(shí)驗(yàn)大鼠在以前飼養(yǎng)環(huán)境中的影響。

1.3.2 光照方式各組大鼠連續(xù)光照1個(gè)月。每只大鼠在光照時(shí)被安置在一個(gè)單獨(dú)的透明管形裝置，大鼠被放置在兩側(cè)燈架的中心， 光源設(shè)置在每個(gè)架子的內(nèi)側(cè)，距離每個(gè)光源15 cm，調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)旋鈕以獲得不同照度的亮度。

1.3.3 各組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色取各組大鼠左眼視網(wǎng)膜，40 g·L-1多聚甲醛固定后，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯置換，石蠟包埋固定，做厚3 μm組織切片，常規(guī)脫蠟梯度酒精脫水后，滴加蛋白酶K室溫消化30 min，PBS沖洗后滴加TUNEL檢測(cè)液，37 ℃孵化60 min，PBS沖洗后滴加DAPI復(fù)染，PBS沖洗染色劑后封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中PARP和GFAP蛋白的表達(dá)取各組大鼠右眼視網(wǎng)膜，冰上操作稱取視網(wǎng)膜組織20 mg，剪碎后放入裂解液提取蛋白，超聲粉碎后冰上孵育30 min，12 000 r·min-1離心30 min后取上清測(cè)定蛋白濃度，按14體積比加入4×蛋白緩沖液，沸水浴10 min冷卻后等量(40 μg)上樣。電泳(恒壓140 V 50 min)，濕法轉(zhuǎn)膜(恒壓100 V，100 min)，洗滌后50 g·L-1脫脂奶粉中封閉2 h，根據(jù)Marker位置剪膜后封裝一抗稀釋液中搖晃過(guò)夜，再次TBST洗滌3次，室溫下孵育2 h，加入按比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。TBST洗滌3次后，暗室曝光，采用ECL發(fā)光液(AB=11)顯影。使用Image J軟件行目的蛋白顯影條帶灰度分析，以確定各組大鼠視網(wǎng)膜中PARP和GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究利用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組大鼠視網(wǎng)膜不同因子蛋白的相對(duì)表達(dá)水平總體比較采用單因素方差分析，各光照組與空白對(duì)照組組間比較采用SNK法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果TUNEL染色結(jié)果顯示，照度1000 lux時(shí)，紅光、綠光、藍(lán)光、白光照射組大鼠視網(wǎng)膜均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞核陽(yáng)性染色(見(jiàn)圖1)。照度2000 lux時(shí)，除空白對(duì)照組和紅光照射組外，綠光、藍(lán)光、白光照射組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層均可見(jiàn)細(xì)胞核的點(diǎn)狀陽(yáng)性著染，提示存在DNA的降解斷端(見(jiàn)圖2)。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜中PARP和GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平照度1000 lux時(shí)，各光照組與空白對(duì)照組相比，GFAP和cleved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見(jiàn)圖3、表1)。照度2000 lux時(shí)，藍(lán)光照射組與空白對(duì)照組相比，cleved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅光、綠光、白光照射組與空白對(duì)照組相比，cleved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；各光照組與空白對(duì)照組相比，GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見(jiàn)圖4、表1)。

圖1 照度1000 lux時(shí),各光照組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果 各光照組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層均未見(jiàn)明顯細(xì)胞核陽(yáng)性染色。

圖2 照度2000 lux時(shí),空白對(duì)照組和各光照組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果 空白對(duì)照組和紅光照射組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞核區(qū)域未見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色細(xì)胞。綠光、藍(lán)光、白光照射組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層細(xì)胞核區(qū)域可見(jiàn)散在的點(diǎn)狀熒光染色，F(xiàn)ICT圖片中的帶狀綠色熒光為視蛋白的自發(fā)熒光。

圖3 照度1000 lux時(shí),Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中PARP和GFAP蛋白表達(dá)結(jié)果

圖4 照度2000 lux時(shí),Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中PARP和GFAP蛋白表達(dá)結(jié)果

表1 照度1000 lux和2000 lux時(shí)各組大鼠視網(wǎng)膜PARP和GFAP的蛋白表達(dá)

3 討論

本研究選用SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是基于嚙齒類動(dòng)物視網(wǎng)膜富含視桿細(xì)胞，在光損傷模型中，視桿細(xì)胞較視錐細(xì)胞更容易表現(xiàn)出光損傷，其主要機(jī)制可能與視桿細(xì)胞中負(fù)責(zé)將視黃醛代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出視細(xì)胞的限速酶活性低于視錐細(xì)胞有關(guān)，并且視錐細(xì)胞除了經(jīng)典的視細(xì)胞-RPE細(xì)胞的視黃醛循環(huán)途徑以外，還具備自身內(nèi)循環(huán)和有周邊Müller細(xì)胞參與的部分視黃醛的代謝，所以相同照度下，視桿細(xì)胞更容易出現(xiàn)視覺(jué)循環(huán)中間產(chǎn)物的堆積，引發(fā)自由基損傷和醛類物質(zhì)氧化損傷的大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的需氧量比其他視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的需氧量高[4]，其中線粒體簇負(fù)責(zé)葡萄糖高強(qiáng)度的氧化代謝[4-5]，導(dǎo)致了大鼠視網(wǎng)膜易受到線粒體代謝影響。而線粒體中的色素吸收峰值為400～450 nm[6-7]，且視紫紅質(zhì)及葉黃素的吸收峰值分別在500 nm和450 nm[7]，都在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，容易受到光照影響導(dǎo)致光損傷。

在視網(wǎng)膜光損傷中，普通認(rèn)可的是基于光誘導(dǎo)的全反式視黃醛，這是光轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)產(chǎn)物之一。全反式視黃醛的加工及其向11-順式-視黃醛生色團(tuán)的轉(zhuǎn)化對(duì)于感光器的生存至關(guān)重要[8-9]。感光細(xì)胞中游離的全反式視黃醛的積累介導(dǎo)了氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。當(dāng)光繼續(xù)照射這些光感受器時(shí)，會(huì)通過(guò)產(chǎn)生超氧自由基和其他活性氧(ROS)引起損傷[8,10]。Sundar等[11]研究證實(shí)，光誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞凋亡是由視紫紅質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的，視紫紅質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是獨(dú)立的，并影響cGMP門控的陽(yáng)離子通道。這些會(huì)導(dǎo)致Ca2+在細(xì)胞中的積累和由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的光感受器變性。同樣，線粒體是鈣中毒[12]和ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所之一。許多研究發(fā)現(xiàn)，感光細(xì)胞的凋亡伴隨著不同來(lái)源的視網(wǎng)膜ROS成分含量升高[13]。這促使氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，并加劇了感光細(xì)胞的變性[14-15]。ROS可與大分子相互作用，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或DNA，從而引起細(xì)胞功能障礙和死亡[16]。此外，視網(wǎng)膜中一氧化氮(NO)含量高，它是一種廣泛存在的神經(jīng)遞質(zhì)[17]。但是，NO也可能與氧或超氧陰離子相互作用，產(chǎn)生極具神經(jīng)毒性的活性氮物質(zhì)(RNS)[18]和過(guò)氧亞硝酸鹽[19-20]。Kutsyr等[14]研究表明，光損傷早期首先發(fā)生在視網(wǎng)膜外層，即感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)和外節(jié)部位，可在較早期出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。由于自由基、ROS及RNS堆積，視黃醛光異構(gòu)化和線粒體代謝異常，免疫熒光染色可見(jiàn)異常熒光分布[21-22]。在所有視網(wǎng)膜退行性疾病中，光感受器變性伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，并伴隨著免疫細(xì)胞作為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集，使組織處于活躍的炎癥狀態(tài)[23-24]。最終引起光感受器變性，進(jìn)而演變?yōu)閺V泛的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)重塑[25]。

本研究檢測(cè)的目標(biāo)蛋白為被上游caspase-3切割活化的PARP片段(cleved-PARP)，其表達(dá)量與組織細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[26]。PARP是一種多功能蛋白質(zhì)的修飾酶，存在于多數(shù)真核細(xì)胞中，它通過(guò)識(shí)別結(jié)構(gòu)損傷的DNA片段而被激活，同時(shí)PARP又是細(xì)胞凋亡核心成員caspase的切割底物[27-28]。GFAP為視網(wǎng)膜早期修復(fù)時(shí)高表達(dá)的蛋白之一，其表達(dá)量的高低提示視網(wǎng)膜組織是否開(kāi)始進(jìn)行損傷后組織修復(fù)[29]。

本研究中結(jié)果顯示，照度2000 lux光照1個(gè)月時(shí)，TUNEL染色結(jié)果提示，除了紅光照射組外，藍(lán)光、綠光、白光照射組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層均出現(xiàn)散在的陽(yáng)性細(xì)胞染色，藍(lán)光照射組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層陽(yáng)性染色更明顯，但Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，只有藍(lán)光照射組cleved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，綠光照射組和白光照射組cleved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。可能的原因是實(shí)驗(yàn)中給出的藍(lán)光波長(zhǎng)中心值在465 nm，最接近線粒體中色素光譜吸收峰值[7,30]?？梢?jiàn)光光譜的一部分藍(lán)光可以被線粒體呼吸鏈發(fā)色團(tuán)吸收，從而引起線粒體動(dòng)力學(xué)的破壞以及ROS的增加[7,31]。而實(shí)驗(yàn)光源紅光(中心波長(zhǎng)620 nm)和綠光(中心波長(zhǎng)525 nm)偏離線粒體色素吸收峰值。另有研究表明[7,14,32-33]，紅光照射可以促進(jìn)線粒體呼吸鏈的電子傳遞速度，從而增加損傷情況下線粒體膜電位的穩(wěn)定性，減少線粒體源性的自由基釋放，相對(duì)于短波長(zhǎng)，相同照射劑量的紅光更難造成光損傷。綠光雖然波長(zhǎng)更加接近視紫紅質(zhì)的吸收峰值[7]，但是本研究中并未見(jiàn)綠光照射組大鼠視網(wǎng)膜凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)，但是可以看到部分綠光照射組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色的陽(yáng)性細(xì)胞，白光照射組出現(xiàn)的情況與綠光照射組相似，這種情況一方面可能因?yàn)榈蛲龀霈F(xiàn)在少量視細(xì)胞中，cleved-PARP并不能敏感地表達(dá)上調(diào)，其他相關(guān)損傷蛋白可能會(huì)有表達(dá)改變，另一方面，不排除部分組織片出現(xiàn)假陽(yáng)性染色的可能。照度2000 lux 光照時(shí)，各組大鼠視網(wǎng)膜中GFAP蛋白均未出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，提示視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并未發(fā)生大量激活、遷移及增殖，各光照組光損傷均未進(jìn)入明顯的凋亡修復(fù)時(shí)期。照度1000 lux光照1個(gè)月時(shí)，TUNEL染色提示各光照組大鼠視網(wǎng)膜均未發(fā)現(xiàn)明顯陽(yáng)性染色細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中cleved-PARP和GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平均未見(jiàn)明顯差異(均為P>0.05)，提示照度1000 lux每天10 min光照1個(gè)月時(shí)，紅光、綠光、藍(lán)光、白光各光照組大鼠均未出現(xiàn)明顯視網(wǎng)膜光損傷表現(xiàn)。在Jaadane等[34]的研究中，使用市售白色LED燈光(功率5 W)照射的大鼠也出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡特征，他們的光照方案采取的是將光源懸掛于籠頂部上方25 cm，在不預(yù)先適應(yīng)黑暗的情況下，連續(xù)將大鼠暴露在光源下6 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間。而本研究中每次光照時(shí)間較短(每天只有10 min)，以便控制大鼠實(shí)際所受的光照強(qiáng)度穩(wěn)定并在大鼠耐受范圍，并把照射周期延長(zhǎng)為 1個(gè)月，因此不同的光照方案和光照時(shí)間可能是結(jié)果差異的原因。

由于本實(shí)驗(yàn)的周期及人力有限，我們只選取了具有代表性的凋亡損傷蛋白PARP和GFAP作為目標(biāo)蛋白檢測(cè)，未能進(jìn)行更大樣本量及更長(zhǎng)時(shí)間的追蹤和重復(fù)研究，取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能因樣本量的原因出現(xiàn)一定的統(tǒng)計(jì)誤差和選擇偏倚。此外，低照度光照對(duì)大鼠視網(wǎng)膜可能存在的累積效應(yīng)需要更長(zhǎng)的照射周期。通過(guò)本研究，也側(cè)面提示了在分析視網(wǎng)膜光損傷時(shí)，不能從日常暴露中排除慢性影響的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榈驼斩鹊腖ED可能不會(huì)誘發(fā)急性視網(wǎng)膜光損傷綜合征，但由于可能存在的累積效應(yīng)，是否會(huì)導(dǎo)致感光細(xì)胞慢性缺失還有待今后進(jìn)一步研究。

致謝：感謝劉文陸博士在本研究中給予的支持和幫助！