翟少倫，婁亞坤，杜麗銀，溫肖會(huì)，翟頎，周秀蓉，賈春玲，霍瑋，陳美霞，楊燕秋，吳國(guó)景，呂殿紅

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/ 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站廣州 510640；2.鄭州中道生物技術(shù)有限公司鄭州 450000；3.紫金縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心廣東河源 517400）

豬圓環(huán)病毒（porcinecircovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），目前基因型分為PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[1,2]。其中PCV1 對(duì)豬無(wú)致病性，PCV2 是目前已知的最小脊椎動(dòng)物病毒之一，基因組大小約為1.7kb，包含2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框，ORF1 和ORF2 分別編碼復(fù)制酶（Re p）和衣殼蛋白（Ca p）。PCV2 自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，相繼在世界各地暴發(fā)流行，主要感染家豬和野豬，可引起母豬繁殖障礙、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、壞死性淋巴結(jié)炎、滲出性皮炎等一系列疾病，且PCV2 感染后可引起免疫細(xì)胞損傷，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，具有養(yǎng)豬業(yè)的“隱形殺手”之稱，使全球養(yǎng)豬業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PCV3 是PCV 的一種新基因型，2015 年在美國(guó)北卡羅來(lái)納州發(fā)生豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙的豬場(chǎng)中最先發(fā)現(xiàn)，之后有報(bào)道稱PCV3 與心肌炎和腎小球腎炎有關(guān)[3,4]。該病毒全基因組大小為2kb，結(jié)構(gòu)與PCV2 類(lèi)似，包括Rep和Cap兩個(gè)主要蛋白，但與PCV2Cap蛋白的同源性較低，約為30%。2017 年湖北、廣東、安徽等多個(gè)省份的豬場(chǎng)陸續(xù)檢測(cè)到PCV3 感染豬群的現(xiàn)象，雖然不同地區(qū)PCV3 全基因組存在差異，但同源性較高。PCV3 感染可能導(dǎo)致豬群發(fā)生如皮炎和腎病綜合征、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、仔豬先天性震顫等一系列相關(guān)疾病。同時(shí)在研究中發(fā)現(xiàn)，豬群中存在PCV2 和PCV3 混合感染的情況，且混合情況較為嚴(yán)重。PCV4 在我國(guó)湖南豬群中發(fā)現(xiàn)，目前的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，其流行率較低，且與豬病的相關(guān)性還不明朗[2,5,6]。

鑒于PCV2 和PCV3 在臨床上的混合感染以及高度相似的臨床特征，因此加強(qiáng)PCV2 和PCV3 的鑒別診斷對(duì)豬圓環(huán)病毒病的防控尤為重要，且建立一種快速、可靠的同時(shí)檢測(cè)PCV2 和PCV3的方法對(duì)于豬圓環(huán)病毒病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查意義重大。

1 引物和探針設(shè)計(jì)

通過(guò)比對(duì)GenBank上收錄的PCV2基因序列，確定保守序列，并針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物探針，用于檢測(cè)PCV2。經(jīng)過(guò)大量設(shè)計(jì)并篩選出PCV2-F1 和PCV2-R1 為上下游引物，PCV2-P1為探針，所述引物組和探針的核苷酸序列分別為：

PCV2-F1：5'-AYAACAAAAGRAATCAG(A)C-3'；

PCV2-R1：5'-TGTACATACATGGTTACACG-3'；

PCV2-P1：5'-FAM-TACGACCAGGAMTACA-BHQ1-3'。

通過(guò)比對(duì)GenBank上收錄的PCV3基因序列，確定保守序列，并針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物探針，用于檢測(cè)PCV3。經(jīng)過(guò)大量設(shè)計(jì)并篩選出PCV3-F2 和PCV3-R2 為上下游引物，PCV3-P2為探針，所述引物組和探針的核苷酸序列分別為：

PCV3-F2：5'-TGGCTCAACACATATGAC-3'；

PCV3-R2：5'-ACGGACTTGTAACGAATC-3'；

PCV3-P2：5'-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ 1-3'。

2 陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建

人工合成PCV2 靶基因序列（Ge nBa nk 登錄號(hào)：KT719404）和PCV3 靶基因序列（Ge nBa nk 登錄號(hào)：MK580466），兩端基因均連接至載體上，將重組的載體DNA 作為陽(yáng)性質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

3 PCR體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

以制備的陽(yáng)性質(zhì)粒，用引物組PCV2-F1、PCV2-R1和PCV3-F2、PCV3-R2，探針PCV2-P1和PCV3-P2在最優(yōu)擴(kuò)增條件下對(duì)稀釋好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：PCV2-F10.166μL，PCV2-R10.211μL，PCV2-P10.203μL，PCV3-F20.190μL，PCV3-R20.188μL，PCV3-P20.247μL，F(xiàn)ast-FireqPCRPreMix12.5μL，DNA模板5μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，3min；95℃變性15s，55℃退火延伸3s，循環(huán)40次，收集熒光信號(hào)，PCV2選擇FAM通道和PCV3選擇HEX通道，獲得擴(kuò)增曲線。

4 PCR特異性試驗(yàn)

分別提取DNA 或RNA，制備豬細(xì)小病毒DNA 基因組、豬偽狂犬病毒DNA 基因組、豬瘟病毒c DNA 全基因組、豬繁殖與呼吸綜合征病毒c DNA 全基因組、豬流行性腹瀉病毒c DNA 全基因組、豬健康組織（血液、皮膚組織）DNA 基因組作為特異性質(zhì)控品，并分別作為模板進(jìn)行熒光PCR 檢測(cè)，按體系配制試劑和設(shè)置反應(yīng)程序。結(jié)果顯示，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，本試劑盒特異性良好。

5 PCR敏感性試驗(yàn)

用紫外吸收法測(cè)重組質(zhì)粒的濃度，先調(diào)整重組質(zhì)粒的濃度至104c op ie s/μL，用d d H2O 對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋?zhuān)♂尫秶鸀?0-1～10-4，分別作為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)。按反應(yīng)體系配制試劑和設(shè)置反應(yīng)程序。結(jié)果顯示，本試劑盒的最低檢出限為10copies/μL，表明本試劑盒有較高的靈敏度，如圖1。

圖1 PCR 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

6 PCR結(jié)果判定

6.1 試驗(yàn)有效性判定

陽(yáng)性對(duì)照在FAM 和HEX 通道均有典型擴(kuò)增曲線且Ct 值≤30，且陰性對(duì)照在FAM 和HEX通道均無(wú)Ct 值、無(wú)擴(kuò)增曲線，則判試驗(yàn)結(jié)果有效；否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。

6.2 樣品判定

1）待檢樣品僅FAM 通道出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38，判定為PCV2 核酸陽(yáng)性；若38＜Ct 值≤40 判定為可疑，建議重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果仍然為Ct 值≤40 則判為陽(yáng)性。無(wú)擴(kuò)增曲線且無(wú)Ct值，判為陰性；

2）待檢樣品僅HEX通道出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38，判定為PCV3 核酸陽(yáng)性；若38＜Ct 值≤40 判定為可疑，建議重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果仍然為Ct 值≤40 則判為陽(yáng)性。無(wú)擴(kuò)增曲線且無(wú)Ct值，判為陰性。

7 PCR臨床應(yīng)用

取實(shí)驗(yàn)室用單重商品化熒光PCR 檢測(cè)試劑盒鑒定為PCV2或PCV3 核酸陽(yáng)性的樣品30 份，分別用本研究建立的PCV2 和PCV3 雙重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法檢測(cè)，結(jié)果與商品化熒光PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致，表明該雙重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法具有更好的集成性和靈敏性。

8 小結(jié)與討論

本研究根據(jù)PCV2 和PCV3 臨床上混合感染的情況，設(shè)計(jì)了特異性的引物和探針，建立了PCV2 和PCV3 二重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法。該方法比傳統(tǒng)的普通PCR 方法、單重?zé)晒釶CR 方法更具有高通量性，適合第三方獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)大量樣品開(kāi)展檢測(cè)。