劉月新，林 艷，謝菁琛，張智敏，廖穎妍，夏伯候*，林麗美

基于夏枯草不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)闡釋“夏枯質(zhì)優(yōu)”的科學(xué)內(nèi)涵

劉月新1, 2，林 艷1, 2，謝菁琛1, 2，張智敏1, 2，廖穎妍1, 2，夏伯候1, 2*，林麗美1, 2

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

基于紫外（UV）和高效液相（HPLC）全息指紋圖譜，化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)與多成分定量相結(jié)合的方法，整合評(píng)價(jià)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的49批夏枯草樣品化學(xué)成分的變化規(guī)律，從而闡明夏枯草由草到藥的演變過(guò)程，解釋夏枯草“夏枯質(zhì)優(yōu)”的科學(xué)內(nèi)涵。建立不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期49批夏枯草樣品的UV和HPLC全息指紋圖譜，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial leastsquares-discriminant analysis，PLS-DA）對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出影響夏枯草分類(lèi)的特異性吸收波段，并對(duì)主要差異性化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定。建立了不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期49批夏枯草樣品的UV和HPLC指紋圖譜，PCA和PLS-DA分析可直觀顯示夏枯草樣品中總的化學(xué)組分在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期時(shí)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)，其中夏枯草枯萎期可以明顯的和其他4個(gè)時(shí)期區(qū)分開(kāi)來(lái)，且其他4個(gè)時(shí)期有向枯萎期動(dòng)態(tài)漸變的趨勢(shì)。UV指紋圖譜通過(guò)PLS-DA 篩選出特異性吸收波段為261 nm，HPLC指紋圖譜利用PLS-DA的變量因子（VIP）分布圖，篩選出VIP值大于1.3的2個(gè)色譜峰，經(jīng)指認(rèn)為異迷迭香酸苷和迷迭香酸，確定為主要差異性化學(xué)成分。對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的夏枯草差異性化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，其中迷迭香酸的含量為0.020%～0.344%；異迷迭香酸苷的含量為0.0016%～0.0988%。多成分定量結(jié)果說(shuō)明，果穗枯萎期中異迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量明顯增加。含量測(cè)定結(jié)果與指紋圖譜模式識(shí)別結(jié)果一致，兩者可相互驗(yàn)證。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)與多成分定量，多種分析方法并用，全方位整合的技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)了對(duì)夏枯草從草到藥的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中整體化學(xué)信息的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。該方法分析全面、操作簡(jiǎn)便，為闡明“夏枯質(zhì)優(yōu)”，規(guī)范夏枯草藥材采收及全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供參考。

夏枯草；紫外指紋圖譜；高效液相指紋圖譜；主成分分析；偏最小二乘法-判別分析；異迷迭香酸苷；迷迭香酸；多成分定量

幾千年來(lái)，中草藥一直被中國(guó)人民用作防治疾病的主要工具，日漸積累寶貴的用藥知識(shí)，并形成一整套中藥理論體系。中藥材與采收時(shí)節(jié)密切相關(guān)。民間就有這樣的俗語(yǔ)：“當(dāng)季是藥，過(guò)季是草”，“三月茵陳四月蒿，五月六月當(dāng)柴燒”，因此，中藥在適宜的時(shí)間采收，直接影響防病治病的效果。

為何中藥一定要到它的最佳采收期采收才可用藥？中藥作為多組分、多靶點(diǎn)的復(fù)合體系，用其中的某一種組分或某一類(lèi)組分來(lái)判定采收時(shí)期，很難從整體上評(píng)價(jià)其結(jié)果，因此，本實(shí)驗(yàn)以夏枯草為例，借助多維指紋圖譜，以及化學(xué)計(jì)量學(xué)等多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的方法[1-3]，建立整合模型，研究總的化學(xué)組分在夏枯草生長(zhǎng)不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，從整體上闡明總的化學(xué)組成與不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期之間的關(guān)系，以科學(xué)的手段解釋夏枯草“夏枯質(zhì)優(yōu)”的科學(xué)內(nèi)涵，它是如何從草到藥的。

夏枯草為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草L.的干燥果穗，具有清肝散火、明目、散結(jié)消腫的功效[4-5]。其藥用部位為果穗，應(yīng)在植株果穗80%現(xiàn)黃漸變成棕褐色時(shí)，趁晴天可擠蔸割下或?qū)⒐敫罨貢窀墒兆?，其表型變化過(guò)程明顯。

中藥從屬于復(fù)雜科學(xué)體系，任何單一方法都無(wú)法清晰準(zhǔn)確揭示中藥復(fù)雜系統(tǒng)的真實(shí)本源，主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）目前廣泛應(yīng)用于藥品食品和農(nóng)產(chǎn)品等的快速識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)以夏枯草為研究對(duì)象，研究“夏枯”前后化學(xué)成分變化的差異性。利用2種指紋圖譜實(shí)現(xiàn)了對(duì)中藥全化學(xué)成分的全面監(jiān)測(cè)，并將多維指紋譜技術(shù)和多元數(shù)據(jù)分析技術(shù)恰當(dāng)整合，使其成為一種綜合鑒別、客觀量化和精準(zhǔn)評(píng)價(jià)中藥的有效可行方法，使中醫(yī)中藥在中藥質(zhì)量控制、中藥藥效成分研究、中藥作用機(jī)制研究等多方面更加科學(xué)化[6-7]。

1 材料

1.1 儀器與試劑

TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Alliance Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，AllianceWaters 2998PDA檢測(cè)器，Empower3色譜工作站（Waters公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP型電子分析天平（賽多利科學(xué)儀器北京有限公司）；所用試劑甲醇、甲酸均為色譜純；水為超純水；對(duì)照品蘆?。ㄅ?hào)B20771）海源葉生物科技有限公司）；異迷迭香酸苷、迷迭香酸均為課題組自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)高效液相色譜法（面積歸一化法）測(cè)定大于98%。

1.2 試藥

1.2.1 夏枯草種植 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園（112°54′E；28°08′N(xiāo)；88 m），土壤為砂質(zhì)黃土壤，肥力中等。播種前施入有機(jī)復(fù)合肥1.2×103kg/hm2作為底肥一次性施入土壤。

1.2.2 夏枯草采收 對(duì)夏枯草生長(zhǎng)階段進(jìn)行劃分，依次分為生長(zhǎng)期（A1～A5）、花始期（B6～B16）、花盛期（C17～C24）、花萎期（D25～D37）和枯萎期（E38～E49）5個(gè)時(shí)期，采集各個(gè)時(shí)期樣本共49份，藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王智教授鑒定為唇形科夏枯草屬植物夏枯草L.。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 紫外用供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取夏枯草藥材粉末（過(guò)40目篩）約0.1 g，加入溶劑2 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取60 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置后取上清液0.5 mL，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，定容至8 mL。即得各樣品紫外指紋圖譜的待測(cè)溶液。

2.1.2 HPLC用供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取49份夏枯草粉末（過(guò)40目篩）約0.2 g，加入溶劑5 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提?。?0 ℃、60 min），放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置后取上清液，微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，即得各樣品高效液相指紋圖譜的待測(cè)溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取異迷迭香酸苷對(duì)照品5.20 mg、蘆丁對(duì)照品2.72 mg、迷迭香酸對(duì)照品4.48 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得各對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.520、0.272、0.448 mg/mL。分別取異迷迭香酸苷溶液、蘆丁溶液、迷迭香酸溶液100、10、500 μL置1 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，3個(gè)對(duì)照品混合溶液質(zhì)量濃度分別為52.00、2.72、224.00 μg/mL。

2.3 夏枯草紫外指紋圖譜的建立

按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備49批夏枯草樣品的供試品溶液，依次置于1 cm石英比色皿中，以40%甲醇溶劑作為參比溶液，進(jìn)行紫外光譜掃描。測(cè)定波長(zhǎng)范圍200～800 nm，狹縫寬度1.0 nm，采樣間隔1 nm，采樣重復(fù)次數(shù)3次。結(jié)合UV Win6.0軟件在200～800 nm內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分辨率為1 nm，獲得600個(gè)點(diǎn)樣。

紫外光譜進(jìn)行3組平均，4點(diǎn)平滑，一階求導(dǎo)處理，以校準(zhǔn)基線和強(qiáng)化譜帶特征，克服譜帶重疊，使圖譜信息清晰直觀。利用PCA、PLS-DA進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，PLS-DA的VIP得分圖分析標(biāo)志性波段，篩選出區(qū)別較大的波數(shù)。以此作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)樣品進(jìn)行高效液相色譜分析。

2.4 夏枯草高效液相指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜色譜條件 色譜柱：Agilent 5HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件為0～10 min：8%～16%A；10～30 min：16%～50%A；30～40 min：50%～75%A；40～45 min：75%～100%A；檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 高效液相指紋圖譜建立 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備49批夏枯草供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)樣品依次進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版）建立49批夏枯草共有模式圖譜，并進(jìn)行相似度分析，以及PCA、PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析

2.5.1 PCA PCA可被視為“多變量數(shù)據(jù)分析中所有方法的母親”。PCA的目標(biāo)是降維，是計(jì)算線性潛變量（組分）的最常用方法。它可從原始變量之間的相互關(guān)系入手，利用方差最大原則，通過(guò)放大原始數(shù)據(jù)中的差異性，并將它們線性轉(zhuǎn)換到主成分上。然后通過(guò)對(duì)主成分作圖，能夠直觀的描述各主成分的差別。它是一種非監(jiān)督的模式識(shí)別方式，反映數(shù)據(jù)的原始情況，有利于對(duì)數(shù)據(jù)從整體上進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了便于觀察不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的夏枯草之間的差異性，在不損失大量信息的條件，利用PCA將高維的紫外、液相指紋圖譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為低維的數(shù)據(jù)。所有的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2.5.2 PLS-DA PLS-DA是有監(jiān)督的模式識(shí)別方式，可彌補(bǔ)PCA模式的不足，凸顯組間差異。2種模式互為補(bǔ)充。目前已成為一種常用于代謝組分學(xué)的分析方法，它可以通過(guò)最大自變量數(shù)據(jù)和應(yīng)變量數(shù)據(jù)集之間的協(xié)方差來(lái)構(gòu)建正交得分向量（潛變量或主成分），從而擬合自變量數(shù)據(jù)和應(yīng)變量數(shù)據(jù)之間的線性關(guān)系。PLS-DA模型的擬合效果通常通過(guò)2、2、2這3個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)，這些指標(biāo)大于0.5較為可信，并且越接近1說(shuō)明PLS-DA模型的擬合效果越好[8-10]。

為了將各不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的夏枯草更好地進(jìn)行分類(lèi)，采用PLS-DA進(jìn)行紫外、液相的指紋圖譜分析。其中液相指紋圖譜數(shù)據(jù)在PLS-DA分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)VIP＞1.3、＜0.05的變量來(lái)篩選導(dǎo)致差異性的主要化學(xué)成分。

2.6 特征成分的含量測(cè)定

分別取49批夏枯草樣品進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算樣品中篩選出的導(dǎo)致差異性主要化學(xué)成分的含量。從成分定量的角度來(lái)說(shuō)明夏枯草從草到藥，即“夏枯質(zhì)優(yōu)”的科學(xué)內(nèi)涵。

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件為0～10 min，12%～30%A；10～15 min，30%～35%A；15～25 min，35%～48%A；25～30 min，48%～60%；30～40 min，60%～70%A；40～45 min，70%～100%A。檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm，柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以迷迭香酸峰（12號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，RSD值應(yīng)小于3%。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析，以迷迭香酸峰（12號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，RSD值應(yīng)小于3%。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份藥材供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h分別測(cè)定，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，RSD值應(yīng)小于3%。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫外指紋圖譜的多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

3.1.1 紫外指紋圖譜分析 將49批夏枯草樣品待測(cè)溶液依次掃描，記錄200～800 nm在線紫外光譜圖，樣品在400～800 nm吸收很低，因此確定提取紫外指紋圖譜在200～400 nm，這部分以反映夏枯草中主要紫外吸收物質(zhì)特征。結(jié)合UV Win6.0軟件在200～400 nm內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分辨率為1 nm，獲得200個(gè)點(diǎn)樣數(shù)據(jù)。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin2017數(shù)據(jù)分析軟件中，紫外指紋圖譜如圖1-A所示?？梢钥闯?，在200～250 nm、250～300 nm、300～400 nm紫外吸收信號(hào)較強(qiáng)，提示可能分別是三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)成分的紫外光譜特征。其中三萜類(lèi)成分可能為熊果酸和齊墩果酸，黃酮類(lèi)可能為蘆丁、蕓香苷等，酚酸類(lèi)成分可能為迷迭香酸、咖啡酸等。圖1-A的紫外指紋圖譜經(jīng)過(guò)Savitzky-Golay平滑再經(jīng)過(guò)一階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換（first derivative），結(jié)果如圖1-B所示。紫外指紋圖譜能夠觀察到夏枯草中所有的化學(xué)成分信息，不同生長(zhǎng)時(shí)期樣品的紫外指紋圖譜特征區(qū)（200～400 nm）峰型和吸收強(qiáng)度存在差異，共有峰提示不同個(gè)體樣品主要成分組成相似，吸收強(qiáng)度差異提示樣品之間主要成分含量存在差異，圖中可以看出，枯萎期的樣品圖譜和其他4個(gè)時(shí)期比較，無(wú)論化學(xué)成分組成或是主要成分含量，都存在較為明顯的差異，圖1-B較圖1-A差異性更為顯著。但紫外指紋圖譜中峰形和吸收值差異卻不能明顯觀察到各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期樣品中化學(xué)成分的變化過(guò)程。故需要對(duì)指紋圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，以區(qū)別不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的樣品。將紫外指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA分析、PLS-DA分析。

3.1.2 PCA分析結(jié)果 為了觀察不同生長(zhǎng)時(shí)期夏枯草之間的差異性，49批樣品所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行PCA分析，從PCA得分圖可以直觀看出，夏枯草不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期基本上分成5類(lèi)，分類(lèi)結(jié)果如圖2-A所示。建立的模型累計(jì)解釋參數(shù)2＝0.987，預(yù)測(cè)能力的參數(shù)2＝0.964，2＞0.5，說(shuō)明該模型的區(qū)分程度和預(yù)測(cè)程度都較好，且結(jié)果在95%置信區(qū)間內(nèi)分類(lèi)結(jié)果可信。此外，除枯萎期外的四個(gè)時(shí)期，依次從生長(zhǎng)期、花始期、花盛期、花萎期化學(xué)成分有明顯的漸變趨勢(shì)，說(shuō)明夏枯草中總的化學(xué)成分是從生長(zhǎng)期開(kāi)始，逐漸向枯萎期動(dòng)態(tài)演變，最終形成突越，使得枯萎期可以明顯的和其他四個(gè)時(shí)期區(qū)分開(kāi)來(lái)，由此說(shuō)明夏枯草生長(zhǎng)期、花始期、花盛期、花萎期，即為“成草期”，歸為一類(lèi)，最終成為可藥用的枯萎期，即為“成藥期”，歸為另一類(lèi)，說(shuō)明它從“草”到藥的演變過(guò)程。

A-夏枯草樣品紫外原始指紋圖譜 B-夏枯草樣品紫外一階導(dǎo)數(shù)圖譜

3.1.3 PLS-DA分析結(jié)果 為了更好地將各不同時(shí)期的夏枯草進(jìn)行區(qū)分，另采用偏最小二乘法-判別分析方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，PLS-DA分析結(jié)果如圖2-B所示。前2主成分2＝0.949，2＝0.523，且結(jié)果在95%置信區(qū)間內(nèi)說(shuō)明分類(lèi)結(jié)果可信。PLS-DA得分圖直觀顯示了49批不同生長(zhǎng)時(shí)期的夏枯草樣品中所含化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。分類(lèi)結(jié)果與PCA分析結(jié)果大體相似，以中間軸為界，所有樣品大致被分為2類(lèi)，左邊為“成草期”，右為“成藥期”。

3.1.4 PLS-DA模型篩選標(biāo)志性波段 通過(guò)PLS-DA變量重要性因子（Variable important for the projection，VIP）分布圖分析，篩選出49份夏枯草樣品中紫外指紋圖譜區(qū)別較大的標(biāo)志性波長(zhǎng)，VIP值可以量化PLS-DA的每個(gè)變量對(duì)分類(lèi)的貢獻(xiàn)，VIP值越大，變量在夏枯草不同生長(zhǎng)時(shí)期的差異越顯著。如圖2-C所示，因溶劑吸收區(qū)在190～210 nm，干擾較大，觀察發(fā)現(xiàn)261 nm處干擾較小，VIP值最大，VIP＞1.6，故選261 nm作為高效液相指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)，如圖2-C所示。

3.2 高效液相指紋圖譜多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

3.2.1 高效液相指紋圖譜的建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版）建立49批夏枯草共有模式圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3-A。

選取時(shí)間寬度為0.1 min，以平均數(shù)生成對(duì)照色譜圖，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)矯正后自動(dòng)匹配，確定13個(gè)特征峰作為評(píng)價(jià)的變量指標(biāo)。并用混合對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)，確定10、11、12號(hào)峰分別為蘆丁、異迷迭香酸苷和迷迭香酸，結(jié)果如圖3所示。

A-夏枯草紫外PCA得分圖 B-夏枯草紫外PLS-DA得分圖 C-PLS-DA模型VIP圖

以上述共有模式為對(duì)照指紋圖譜，對(duì)49批夏枯草的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，夏枯草的相似度在0.24～1.00，表明不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期夏枯草相似度較低，差異較大，將相似度評(píng)價(jià)結(jié)果采用熱點(diǎn)圖形式呈現(xiàn)，如圖4所示。（顏色差異大說(shuō)明相似度差異大，顏色偏藍(lán)偏紫的部分說(shuō)明相似度較?。?，為更好的進(jìn)行分類(lèi)，需進(jìn)一步采用其他化學(xué)模式識(shí)別方法[11]。

采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版）分析夏枯草HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)，以共有峰峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA分析。

3.2.2 PCA分析結(jié)果 為了觀察不同時(shí)期夏枯草之間的差異性，從PCA得分圖可知，夏枯草不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期能基本分為5類(lèi)，分類(lèi)結(jié)果如圖5-A所示。建立的模型累計(jì)解釋參數(shù)2＝0.773，預(yù)測(cè)能力的參數(shù)2＝0.512，說(shuō)明該模型的區(qū)分程度和預(yù)測(cè)程度都較好。結(jié)果與紫外指紋圖譜分析結(jié)果一致，可以看出，依次從生長(zhǎng)期、花始期、花盛期、花萎期化學(xué)成分有明顯的動(dòng)態(tài)漸變趨勢(shì)，最終的枯萎期則可以明顯的和其他4個(gè)時(shí)期區(qū)分開(kāi)來(lái)，這個(gè)動(dòng)態(tài)漸變趨勢(shì)與紫外指紋圖譜的分析結(jié)果一致。

3.2.3 PLS-DA分析結(jié)果 對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期夏枯草高效液相指紋圖譜結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行PLS-DA分類(lèi)分析。分類(lèi)結(jié)果如圖5-B所示，前2主成分2＝0.744，2＝0.541，說(shuō)明分類(lèi)結(jié)果較為可信，PLS-DA得分圖中的每一個(gè)點(diǎn)代表每一個(gè)樣品，復(fù)雜的譜圖信息在PLS-DA得分圖中能直觀顯示不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和樣品之間的關(guān)系，圖譜相似的樣品聚在較近區(qū)域，圖譜差異大的樣品聚在較遠(yuǎn)區(qū)域，圖中枯萎期的樣品與其他4個(gè)時(shí)期的樣品差異性較大，因此聚在較遠(yuǎn)區(qū)域，而夏枯草的生長(zhǎng)期、花始期、花盛期、花萎期，4個(gè)“成草期”的樣品差異性較小，相互貼近，聚在較近的區(qū)域，并且有向枯萎期轉(zhuǎn)變的漸變趨勢(shì)。圖中直觀展現(xiàn)了夏枯草從草到藥的演變歷程。PCA和PLS-DA分析結(jié)果互為補(bǔ)充，相互驗(yàn)證，所得結(jié)果具有科學(xué)客觀性。

10-蘆丁 11-異迷迭香酸苷 12-迷迭香酸

圖4 夏枯草相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

A-夏枯草液相PCA得分圖 B-夏枯草液相PLS-DA得分圖 C、D-VIP標(biāo)志物差異圖

本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)運(yùn)用PLS-DA方法進(jìn)一步分析。根據(jù)VIP＞1.3、＜0.05的變量來(lái)篩選導(dǎo)致差異性的主要化學(xué)成分，提取PLS-DA模型中13個(gè)變量的VIP值，對(duì)13個(gè)共有峰峰面積VIP值大小進(jìn)行排列，結(jié)果如圖5-C、5-D所示，選擇VIP值大于1.3的共有峰，依次為12號(hào)峰（VIP值：1.564 1）、11號(hào)峰(VIP值：1.327 1)，說(shuō)明以上化學(xué)成分對(duì)夏枯草樣品分類(lèi)具有顯著的影響，這些成分是引起不同生長(zhǎng)時(shí)期的夏枯草成分差異的主要標(biāo)志性成分。經(jīng)過(guò)對(duì)照指認(rèn)，確認(rèn)11號(hào)峰為異迷迭香酸苷，12號(hào)峰為迷迭香酸，10號(hào)峰為蘆丁，而10號(hào)峰并未出現(xiàn)在VIP＞1.3的色譜峰中，則提示它并不是夏枯草不同時(shí)期內(nèi)在成分差異的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗(yàn) 按“2.6.2”項(xiàng)下方法考察儀器精密度。結(jié)果顯示，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.45%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為1.23%，均小于3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.6.3”項(xiàng)下方法考察方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.27%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為2.23%，均小于3%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.6.4”項(xiàng)下方法考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.58%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為2.42%，均小于3%，說(shuō)明夏枯草供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 特征成分的含量測(cè)定

對(duì)“2.2”項(xiàng)混合對(duì)照品按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量分別為1、2、4、6、8、10 μL，記錄峰面積。以2種成分的質(zhì)量為橫坐標(biāo)（）和峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸，得異迷迭香酸苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍為＝213 600－1 945.7，線性范圍為0.052～0.520 μg,2＝0.999 7；迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍為＝264 756－8 535.1，線性范圍為0.004 4～0.140 8 μg,2＝0.999 7。以標(biāo)準(zhǔn)曲線為參照，對(duì)夏枯草不同時(shí)期2種成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

夏枯草活性成分隨著植物的生長(zhǎng)不斷發(fā)生變化，其中異迷迭香酸苷和迷迭香酸2個(gè)活性成分占據(jù)主導(dǎo)作用。為進(jìn)一步分析2種活性成分在夏枯草生長(zhǎng)過(guò)程中變化規(guī)律，采用HPLC法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示，異迷迭香酸苷隨著果穗的不斷枯萎，其含量明顯增加，枯萎期含量最高，異迷迭香酸苷的含量為0.001 6%～0.098 8%（＜0.01）；迷迭香酸含量在夏枯草枯萎前期較低，隨著果穗不斷的枯萎，其含量變化明顯，到枯萎期含量達(dá)到最高，迷迭香酸的含量為0.02%～0.344%（＜0.01）。

表1 夏枯草不同時(shí)期2種成分含量變化

**＜0.01，顯著性差異

**< 0.01, significant difference

自夏枯草列入《中國(guó)藥典》以來(lái)，迷迭香酸含量一直作為夏枯草質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定迷迭香酸含量不得低于0.2%，這說(shuō)明只有當(dāng)夏枯草完全枯萎時(shí)，其藥效方能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)“夏枯質(zhì)優(yōu)”進(jìn)行了闡釋?zhuān)矊?duì)夏枯草的栽培采收提供參考依據(jù)。上述迷迭香酸和異迷迭香酸苷含量測(cè)定結(jié)果與指紋圖譜模式識(shí)別結(jié)果一致，兩者可相互驗(yàn)證。

4 討論

夏枯草的主要藥效成分較為復(fù)雜，不同極性溶劑提取的成分組成和含量存在差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品的提取溶劑、溶劑濃度、提取時(shí)間進(jìn)行考察，以A1樣品為分析對(duì)象，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0g樣品3份，分別加入超純水、甲醇和乙醇，超聲提取，方法同“2.3”項(xiàng)。依次測(cè)定紫外光譜圖?？疾椴煌崛∪芤旱奈辗鍞?shù)目，吸收強(qiáng)度，確定最佳提取溶劑。最終采用40%甲醇超聲提取60 min作為前處理方法。該條件下所得峰的數(shù)量較多，且操作簡(jiǎn)便。

中藥指紋圖譜分析方法大多數(shù)以色譜指紋圖譜為主，近年來(lái)，由于中藥提取液中包含整體化學(xué)物質(zhì)組分，光譜指紋圖譜更能從宏觀、整體上清晰提供所含全部化學(xué)成分方面的信息。其中紫外光譜能夠反映樣品中所有不飽和化學(xué)鍵（如雙鍵、三鍵、共軛體系及助色團(tuán)）的特征規(guī)律信息，依據(jù)峰形、收波長(zhǎng)和吸光度的不同，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法探討供試樣品的差異，在中藥鑒別方面應(yīng)用較為廣泛[11-14]。再加上其樣品前處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間較短，檢測(cè)成本低廉等特點(diǎn)受到廣大分析工作者的日益關(guān)注。因此光譜指紋圖譜可以輔助色譜指紋圖譜從整體上實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥的科學(xué)化研究和評(píng)價(jià)。

指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)能有效地區(qū)別不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期夏枯草樣品，其中PCA分析可以實(shí)現(xiàn)將大量的變量降維成二維空間數(shù)據(jù)，降低觀測(cè)空間的維數(shù)，以獲取最主要的信息，通?？梢酝ㄟ^(guò)少數(shù)幾個(gè)主成分即可最大限度地描述數(shù)據(jù)特點(diǎn)，對(duì)樣品加以區(qū)分。復(fù)雜的紫外光譜圖信息和液相色譜圖信息可以在PCA和PLS-DA得分圖中直觀顯示夏枯草樣品中總的化學(xué)組分在不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程，夏枯草枯萎期可明顯和其他時(shí)期區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明枯萎期所包含化學(xué)成分無(wú)論從組成或是含量都發(fā)生了質(zhì)的改變，由此闡明夏枯草“夏枯質(zhì)優(yōu)”的科學(xué)內(nèi)涵，它是如何從草到藥的。

《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定的夏枯草質(zhì)量控制組分為迷迭香酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，而本研究的液相指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)是在紫外指紋圖譜指導(dǎo)下，通過(guò)PLS-DA變量重要性因子VIP分布圖篩選出區(qū)別較大的標(biāo)志性波長(zhǎng)，即261 nm。藥典中是以單一組分作為質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，但中藥本身是個(gè)多種成分的集合體，以單一組分控制中藥質(zhì)量并不全面，本實(shí)驗(yàn)是把夏枯草中所有化學(xué)組分看作一個(gè)整體，收集49批不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期夏枯草樣品，并通過(guò)紫外指紋圖譜、高效液相指紋圖譜與PCA、PLS-DA模式識(shí)別方法相結(jié)合，以及對(duì)差異性成分定量的方法，來(lái)比較不同時(shí)期夏枯草樣品的差異性。從而闡明夏枯草由草到藥的演變過(guò)程。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)多了一個(gè)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的參考檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm，對(duì)于完善夏枯草的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有一定參考意義，目前，由于采收不同時(shí)期的時(shí)間較短，收集的夏枯草各個(gè)時(shí)期的樣品批次還相對(duì)較少，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以增加樣品批次，細(xì)化不同時(shí)期采收的時(shí)間、方法，不斷修正夏枯草的特征圖譜。

目前對(duì)夏枯草的研究較為片面，主要集中在其果穗枯萎階段。以往文獻(xiàn)對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期夏枯草化學(xué)成分變化規(guī)律的研究也只局限于一、兩個(gè)或幾大類(lèi)成分為指標(biāo)，難以全面反映夏枯草次生代謝產(chǎn)物累積變化規(guī)律。本課題以夏枯草為研究對(duì)象，從整個(gè)植物動(dòng)態(tài)發(fā)育角度進(jìn)行分析，從整體上闡明總的化學(xué)組成與夏枯草不同生長(zhǎng)時(shí)期之間的關(guān)系，跟蹤整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，以科學(xué)的手段解釋夏枯草“夏枯質(zhì)優(yōu)”的科學(xué)內(nèi)涵，該方法分析全面、操作簡(jiǎn)便，為規(guī)范夏枯草藥材采收及藥材科學(xué)、合理加工方法的確定提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Scientific connotation of “summer withering with good quality” based on dynamic monitoring of chemical constituents at different growth and development stages of

LIU Yue-xin1, 2,LIN Yan1, 2, XIE Jing-chen1, 2,ZHANG Zhi-min1, 2, LIAO Ying-yan1, 2, XIA Bo-hou1, 2,LIN Li-mei1, 2

1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Hunan Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs, Changsha 410208, China

Based on the UV and HPLC fingerprints ofsamples, combined with multi-component quantitative analysis and chemical pattern recognition methods, the changes of chemical components in 49 batches ofsamples at different growth stages were evaluated, so as to clarify the evolution process offrom herbs to medicines, and explain the scientific connotation of “summer withering with good quality” of.UV and HPLC holographic fingerprints of 49 batches ofsamples at different growth stages were established, which were evaluated by principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA). The specific absorption bands affecting the classification ofwere screened out. The chemical constituents that cause the difference ofat different growth and development stages were determined.UV and HPLC fingerprints of 49 batches ofsamples at different growth stages were established. PCA and PLS-DA analysis intuitively showed the dynamic changes of total chemical components insamples at different growth stages. The withering period ofcan be clearly distinguished from the other four periods, and the other four periods had a trend of dynamic gradual change towards the withering period. The specific absorption band of UV fingerprint was 261 nm through PLS-DA. By using the VIP distribution map of PLS-DA, two peaks with VIP value greater than 1.3 were screened out by HPLC fingerprint. Isorosmarin and rosmarinic acid were identified as the main differential chemical components. Determination of chemical components ofin different growth stages was carried out, The content of rosmarinic acid was 0.020%—0.344%. The content of isorosmarin was 0.0016%—0.0988%. Multi-component quantitative results showed that the contents of isorosmarin and rosmarinic acid increased significantly in the withering period of cluster. The results of the content determination were consistent with the fingerprint pattern recognition results, and they can be verified mutually.Fingerprint combined with chemical pattern recognition methods and multi-component quantitative analysis was used to monitor the overall chemical information ofduring the whole growth and development process from herbs to medicines. This method is comprehensive and easy to operate. It can be used as a reference for elucidating the “summer withering with good quality”, standardizing the collection ofand comprehensively evaluating its quality.

L.; UV fingerprint; HPLC fingerprint; principal component analysis; partial least squares method-discriminant analysis; isorosmarin; rosmarinic acid; multi-component quantification

R286.2

A

0253 - 2670(2021)07 - 2082 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.025

2020-08-09

長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目（kq2004063）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)開(kāi)放基金項(xiàng)目（2020ZYX11）

劉月新（1983—），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: 158769882@qq.com

夏伯候（1983—），男，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail: 411816629@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]