曹 建，朱曉燃，楊振寰，索菲婭，姚樹(shù)坤, , 3*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用機(jī)制

曹 建1，朱曉燃2，楊振寰2，索菲婭2，姚樹(shù)坤1, 2, 3*

1. 北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 3. 中日友好醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100029

探討清肝化瘀顆粒治療肝癌的有效成分、作用靶點(diǎn)及可能作用機(jī)制。通過(guò)中藥與疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具篩選清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要有效成分與作用靶點(diǎn)，分析作用靶點(diǎn)的分子機(jī)制，構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證清肝化瘀顆粒核心有效成分苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞學(xué)行為的作用，并檢測(cè)苦參堿對(duì)核心靶點(diǎn)及主要信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。共篩選出清肝化瘀顆粒治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)86個(gè)，富集分析結(jié)果顯示作用靶點(diǎn)共涉及生物過(guò)程20種，細(xì)胞組成15種，分子功能20種，以及信號(hào)通路20條。利用構(gòu)建的“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)清肝化瘀顆粒主要通過(guò)槲皮素、木犀草素及苦參堿對(duì)腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）及G1/S期特異細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）等核心靶點(diǎn)參與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬等與肝癌有關(guān)的腫瘤生物學(xué)行為發(fā)揮治療肝癌的作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，清肝化瘀顆粒有效成分苦參堿以劑量相關(guān)的方式抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并能調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激脅迫標(biāo)志物，同時(shí)可對(duì)TP53、VEGFA及CCND1等核心靶點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)。肝癌荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2荷瘤裸鼠具有抑瘤作用，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)能調(diào)節(jié)線粒體自噬及線粒體分裂2種線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程相關(guān)蛋白的表達(dá)量。清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要機(jī)制包括以槲皮素、木犀草素及苦參堿為代表的多成分，以TP53、VEGFA及CCND1為代表的多靶點(diǎn)，以細(xì)胞凋亡、線粒體穩(wěn)態(tài)及氧化應(yīng)激為代表的多通路調(diào)節(jié)的系統(tǒng)性、協(xié)同性作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；清肝化瘀顆粒；肝癌；苦參堿；分子機(jī)制；槲皮素；木犀草素

肝癌目前已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)第6大常見(jiàn)癌癥，其致死率位居全球第4[1]。我國(guó)是肝癌大國(guó)，在全球肝癌的發(fā)病中，肝癌的發(fā)病率為46.6%，病死率為47.1%[2]。在我國(guó)肝癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化的5年生存率僅為12.1%[3]，因此，我國(guó)的肝癌防治工作在全球肝癌的防治工作中占據(jù)舉足輕重的位置。肝癌起病隱匿，致死率高，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展至中晚期，其發(fā)病率與死亡率之比接近1，在全世界范圍內(nèi)造成了廣泛的醫(yī)療負(fù)擔(dān)與社會(huì)負(fù)擔(dān)[4]。外科手術(shù)切除目前仍是肝癌患者的最佳治療手段，但是這種治療手段對(duì)肝癌患者所處的分期與肝臟功能要求較高，且受到遠(yuǎn)期療效與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的局限[5]。因此，繼續(xù)探索與研發(fā)有效的肝癌治療策略很有必要。

隨著我國(guó)中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥參與到癌癥臨床治療的各個(gè)階段[6]，發(fā)揮著減輕治療手段的毒副反應(yīng)、提高癌癥治療效果、延長(zhǎng)癌癥患者生存期、提高癌癥患者治療后生存質(zhì)量等重要作用[7-8]。清肝化瘀顆粒是本課題組將多年肝癌臨證經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芩、苦參、白術(shù)、莪術(shù)、白花蛇舌草、半枝蓮、三棱及甘草8味中藥組成[9]，臨床實(shí)踐顯示出較好的肝癌治療效果[10]，前期的臨床前研究也揭示了其在抑制肝癌細(xì)胞增殖中可能的細(xì)胞學(xué)與分子生物學(xué)機(jī)制[11-12]。清肝化瘀顆粒組方有效成分眾多，作用靶點(diǎn)與靶信號(hào)通路相互作用機(jī)制復(fù)雜，其在抑制肝癌中的具體分子機(jī)制尚待闡明。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具預(yù)測(cè)了清肝化瘀顆粒治療肝癌的潛在有效成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了清肝化瘀顆粒主要有效成分苦參堿的作用及其對(duì)核心靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用，旨在揭示清肝化瘀顆粒在肝癌中發(fā)揮治療效果的可能有效成分及其分子機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床前研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)的收集與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php，version2.3）[13]進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，收集清肝化瘀顆粒組方8味中藥的有效成分與作用靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)既往中藥活性成分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果分析[14]，本研究將人體口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，腸上皮Caco-2細(xì)胞滲透性＞0 nm/s，半衰期（half-time，HL）≥4 h，氫鍵供體數(shù)目（Hdon）＜5個(gè)及氫鍵受體數(shù)目（Hacc）＜10個(gè)設(shè)置為有效成分的篩選參數(shù)。

同時(shí)利用肝癌數(shù)據(jù)庫(kù)OncoDB.HCC（http:// oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm）[15]及Liverome（http:// liverome.kobic.re.kr/index.php）[16]中的肝癌基因組數(shù)據(jù)對(duì)肝癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行搜集與篩選?；趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本研究納入OncoDB.HCC數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有靶點(diǎn)及Liverome數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)譜證據(jù)≥5條的靶點(diǎn)作為肝癌疾病靶點(diǎn)。

將以上兩者預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)結(jié)果取交集，進(jìn)一步確認(rèn)清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用靶點(diǎn)?；诖俗饔冒悬c(diǎn)集合，運(yùn)用STRING（https://string-db.org/，version 11.0）及Cytoscape（version 3.7.2）軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，利用MCODE插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)中的分子相互作用模塊，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選條件設(shè)置為度值臨界值（degree cutoff）＝2，K核（K-core）＝2。同時(shí)利用CytoHubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)進(jìn)行研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本研究選擇最大團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）算法獲取核心靶點(diǎn)信息并按照重要度大小對(duì)其進(jìn)行排序。

將篩選得到的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定參數(shù)為最小重疊度（min overlap）＝3，P臨界值（P cutoff）＝0.01，最小富集度（min enrichment）＝1.5，對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及基因本體（gene ontology，GO）富集分析，并使用R語(yǔ)言（version 3.0.6）中的ggplot2（version 3.3.0）程序包對(duì)富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶向信號(hào)通路示意圖進(jìn)行繪制。

1.2 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將所獲得的清肝化瘀顆粒組方中藥的有效成分及所獲取的作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路分別導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并利用網(wǎng)絡(luò)分析（network analyzer）功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖的特征進(jìn)行分析，并獲取主要有效成分及核心靶點(diǎn)信息。

1.3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.1 材料 HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；分析純級(jí)苦參堿（貨號(hào)M5319）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3.2 細(xì)胞模型構(gòu)建與細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞以含10%胎牛血清（購(gòu)自GIBCO，貨號(hào)10270-106）的RPMI 1640培養(yǎng)基（購(gòu)自GIBCO，貨號(hào)11875093）置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè) 使用Cell Counting Kit-8（購(gòu)自Dojindo，日本，CK04）進(jìn)行CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后使用等量的不同濃度的苦參堿（1、5、10 nmol/L）給藥并繼續(xù)培養(yǎng)12 h，同時(shí)設(shè)置等量的不含苦參堿培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。中止培養(yǎng)后，每個(gè)培養(yǎng)孔加入CCK-8溶液10 μL，避免引入氣泡，同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞，僅添加不同濃度藥物及CCK-8溶液的培養(yǎng)孔作為空白組。在培養(yǎng)箱中孵育4 h，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，于450 nm處測(cè)定各孔的吸光度（），并按照下述公式計(jì)算細(xì)胞的生存率。同時(shí)確定苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞的最小抑制濃度。

細(xì)胞生存率＝(苦參堿－空白)/(對(duì)照－空白)

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用Annexin V，F(xiàn)ITC Apoptosis Detection Kit（購(gòu)自Donjindo，日本，AD10）進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。肝癌細(xì)胞的收集與接種按照“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為對(duì)照組（等量的不含苦參堿的培養(yǎng)基處理）、苦參堿組（給藥濃度采用“1.3.3”項(xiàng)下確定的苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞的最小抑制濃度）、苦參堿聯(lián)合細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK組（z-VAD-FMK濃度為10 μmol/L，苦參堿給藥濃度與苦參堿組相同）、z-VAD-FMK組（僅添加10 μmol/L z-VAD-FMK）。收集細(xì)胞后加入10倍體積的Annexin V結(jié)合溶液，重懸細(xì)胞使細(xì)胞終濃度為1×106個(gè)/mL。吸取100 μL細(xì)胞懸液加入到新的流式管中，加入5 μL Annexin，F(xiàn)ITC聚合物，隨后加入5 μL PI溶液。室溫條件下，避光，孵育15 min，在流式管中加入10倍體積的Annexin V結(jié)合溶液，在流式細(xì)胞儀中上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè) 使用總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0052）及總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0101）進(jìn)行細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)。肝癌細(xì)胞的收集與接種按照“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行，苦參堿組給藥濃度為1、5 nmol/L，同時(shí)設(shè)置等量的不含苦參堿的培養(yǎng)基處理的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照組。收集細(xì)胞后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞裂解、檢測(cè)體系構(gòu)建及后續(xù)反應(yīng)，最后分別在酶標(biāo)儀412 nm及450 nm處記錄并計(jì)算GSH及SOD的活性變化程度。

1.3.6 ELISA法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）含量 使用VEGFA定量檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自R&D SYSTEMS，SVE00）進(jìn)行VEGFA檢測(cè)。肝癌細(xì)胞的收集、接種及給藥按照“1.3.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行。收集細(xì)胞后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞裂解、檢測(cè)體系構(gòu)建及后續(xù)反應(yīng)，中止反應(yīng)后將反應(yīng)體系置于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定并計(jì)算VEGFA的含量。

1.3.7 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白水平 肝癌細(xì)胞的收集、接種及給藥按照“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行。各組細(xì)胞提取總蛋白后，利用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（購(gòu)自Solarbio，PC0020）對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定。使用濃度為10%的SDS-PAGE蛋白電泳后將目的條帶轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上。使用一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜后，用TBST緩沖液清洗3次，與二抗室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光法對(duì)凝膠圖像進(jìn)行顯影及定影，并進(jìn)行掃描存檔。本研究中使用的第一抗體信息：抗腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）抗體（Abcam，ab26），抗G1/S期特異細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）抗體（Abcam，ab16663）；內(nèi)參蛋白第一抗體信息：抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（CST，5174）；第二抗體信息：羊抗鼠-辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）（CST，7076），羊抗兔-HRP（CST，7074）。

1.4 肝癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.4.1 肝癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型的建立、分組與給藥 雄性SPF級(jí)BALB/C裸鼠，6周齡，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體質(zhì)量（17.6±2.3）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。所有裸鼠分籠飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，采用12 h光/暗周期，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，取材前12 h禁食。肝癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型的建立與分組參考朱丹丹等[17]的方法，隨機(jī)分為對(duì)照組和苦參堿給藥組，每組各5只。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2人肝癌細(xì)胞，調(diào)整濃度至5×107個(gè)/mL，使用一次性注射器將細(xì)胞sc至裸鼠右側(cè)腋窩，0.1 mL/只，連續(xù)10 d，瘤塊長(zhǎng)至約5 mm×5 mm×5 mm認(rèn)為造模成功。對(duì)照組ip生理鹽水1 mL，1次/d，參考朱丹丹等[17]前期的研究結(jié)果，苦參堿給藥組用藥劑量為50 mg/kg，ip 1.0 mg/mL苦參堿溶液1 mL，1次/d。連續(xù)給藥28 d。

1.4.2 移植瘤瘤體HE染色病理檢查 將裸鼠瘤塊剝離后置于標(biāo)記編號(hào)的包埋盒中，利用乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，并于58～60 ℃的石蠟中浸蠟，包埋，4 ℃過(guò)夜后置于切片機(jī)上，厚度調(diào)整為4 μm，連續(xù)切片，60 ℃烤片后脫蠟，使用蘇木素及0.5%伊紅染液染色，利用中性樹(shù)膠封片后置于顯微鏡下采集圖像。

1.4.3 移植瘤瘤體TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 石蠟切片脫蠟后利用PBS溶液漂洗3次，并將切片置于煮沸的抗原修復(fù)液中修復(fù)抗原10 min，冷卻至室溫后加入100 μL蛋白酶K，濕盒中透明20 min，PBS漂洗后于3% H2O2溶液中孵育封閉10 min，加入100 μL陽(yáng)性片孵育液，37 ℃濕盒孵育30 min，滴加50 μL標(biāo)記反應(yīng)液，37 ℃濕盒孵育90 min，加入PI染液50 μL，室溫反應(yīng)5 min，60 ℃烘箱中干燥后，使用含DAPI的抗熒光猝滅封片劑封片，置于顯微鏡下采集圖像。

1.4.4 免疫組化及Western blotting法檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子的表達(dá)水平 石蠟切片脫蠟后利用PBS溶液漂洗3次，并將切片置于煮沸的抗原修復(fù)液中修復(fù)抗原10 min，使用免疫組化筆圈定待測(cè)組織區(qū)域，區(qū)域內(nèi)加100 μL的3%H2O2，孵育10 min，加入100 μL封閉液，室溫條件下于濕盒中孵育1 h，加入一抗后，4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜，PBS沖洗后加入二抗，室溫條件下濕盒中孵育1 h，以1∶100的體積比加入適量HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫濕盒中孵育30 min，加入100 μL新鮮配制的DAB顯色液，室溫孵育7 min，加入蘇木素染色液染色7 min，隨后放入自來(lái)水10 min進(jìn)行返藍(lán)，置于60 ℃烘箱中干燥后封片并置于顯微鏡下拍照。Western blotting實(shí)驗(yàn)方法采用“1.3.7”項(xiàng)下方法。第一抗體信息：抗MST1抗體（Genetex，GTX109294），抗Parkin抗體（Bioworld，BS91016），抗哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1）抗體（Genetex，GTX109294），抗磷酸化的c-Jun氨基末端激酶（p-c-Jun-terminal kinase，p-JNK）抗體（CST，4668T），抗PTEN誘導(dǎo)的激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）抗體（Bioworld，BS91075），抗Parkin抗體（Bioworld，BS91016）；第二抗體信息：羊抗兔IgG（H＋L）HRP（Bioworld，BS13278），羊抗兔-HRP（CST，7074）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)獲取及“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究經(jīng)數(shù)據(jù)挖掘得到清肝化瘀顆粒有效成分161種，其中重復(fù)成分17種，包含于2味中藥的重復(fù)成分12種，包含于3味中藥的重復(fù)成分2種，包含于4味中藥的重復(fù)成分3種。同時(shí)獲得上述有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)276個(gè)。利用肝癌數(shù)據(jù)庫(kù)Liverome及OncoDB.HCC數(shù)據(jù)庫(kù)共收集得到994個(gè)肝癌疾病靶點(diǎn)。將獲得的清肝化瘀顆粒有效成分作用靶點(diǎn)及肝癌疾病靶點(diǎn)相互映射，得到86個(gè)交集靶點(diǎn)，即為清肝化瘀顆粒治療肝癌潛在作用靶點(diǎn)。將共有靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的中藥、有效成分與對(duì)應(yīng)的疾病信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

KuS-苦參 BanZL-半枝蓮 HuangQ-黃芩 BaiZ-白術(shù) SheSC-白花蛇舌草 GanC-甘草 SanL-三棱 Ezh-莪術(shù) HCC-肝癌

“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)包括中藥節(jié)點(diǎn)8個(gè)（圖中以正方形顯示），組方中藥有效成分節(jié)點(diǎn)136個(gè)（圖中以圓形顯示），靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)86個(gè)（圖中以菱形顯示），疾病節(jié)點(diǎn)1個(gè)（圖中以三角形顯示），以及1299種“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”對(duì)應(yīng)關(guān)系（圖中以黑色直線顯示）。在中藥水平，對(duì)應(yīng)有效成分?jǐn)?shù)目由多到少的中藥分別為甘草（83種有效成分）、黃芩（28種有效成分）、苦參（20種有效成分）、半枝蓮（18種有效成分）、白花蛇舌草及三棱（各4種有效成分）、白術(shù)及莪術(shù)（各1種有效成分）。在化合物水平，按對(duì)應(yīng)治療肝癌的靶點(diǎn)數(shù)目由多到少的化合物有槲皮素（對(duì)應(yīng)59個(gè)靶點(diǎn)），木犀草素（對(duì)應(yīng)24個(gè)靶點(diǎn)）及苦參堿（對(duì)應(yīng)16個(gè)靶點(diǎn)）等。在靶點(diǎn)蛋白層面，連接化合物數(shù)目較高的靶點(diǎn)有9×104熱休克蛋白αA1（HSP90AA1，對(duì)應(yīng)有效成分105種）、TP53（對(duì)應(yīng)有效成分93種）及VEGFA（連接化合物數(shù)目60種）等，86個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)中，有46個(gè)節(jié)點(diǎn)與2個(gè)及2個(gè)以上的化合物相連接，占全部靶點(diǎn)的53.5%。清肝化瘀顆粒組方中藥治療肝癌作用靶點(diǎn)蛋白數(shù)目如下：苦參治療肝癌靶點(diǎn)數(shù)目為70個(gè)（占苦參預(yù)測(cè)靶點(diǎn)總數(shù)的34.8%，下同），黃芩31個(gè)（25.2%），白術(shù)2個(gè)（10.5%），莪術(shù)4個(gè)（18.2%），半枝蓮72個(gè)（32.3%），白花蛇舌草62個(gè)（33.9%），三棱15個(gè)（18.8%），甘草75個(gè)（32.8%）。該網(wǎng)絡(luò)中，每味中藥對(duì)應(yīng)平均靶點(diǎn)數(shù)目為10.75，每種中藥成分對(duì)應(yīng)的平均靶點(diǎn)數(shù)量0.63，每個(gè)靶點(diǎn)平均對(duì)應(yīng)成分1.58個(gè)。

2.2 清肝化瘀顆粒治療肝癌核心靶點(diǎn)的篩選與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)及MCODE和cytoHubba插件對(duì)清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。如圖2所示，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，評(píng)分較高的核心靶點(diǎn)有TP53、CCND1、VEGFA、原癌基因蛋白c-myc（proto-oncogene protein c-myc，MYC）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等，以上作用靶點(diǎn)均為PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高且受到多味中藥及有效成分調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)蛋白。

圖2 清肝化瘀顆粒治療肝癌的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程分析

利用在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Metascape對(duì)得到的清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能注釋分析。如圖3所示，GO生物學(xué)途徑分析得到20個(gè)條目，分別為細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（29個(gè)靶點(diǎn)參與）、氧含量響應(yīng)途徑（23個(gè)靶點(diǎn)參與）及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路（20個(gè)靶點(diǎn)參與）等。GO細(xì)胞組分分析共得到15個(gè)條目，分別為細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物（8個(gè)靶點(diǎn)參與）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（7個(gè)靶點(diǎn)參與）及線粒體膜（10個(gè)靶點(diǎn)參與）等。GO分子功能分析共得到20個(gè)條目，分別為激酶結(jié)合功能（21個(gè)靶點(diǎn)參與）、激酶調(diào)節(jié)活性（12個(gè)靶點(diǎn)參與）及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合功能（9個(gè)靶點(diǎn)參與）等。KEGG代謝信號(hào)通路富集分析得到20個(gè)條目，分別為癌癥相關(guān)通路（34個(gè)靶點(diǎn)參與）、含鉑類藥物耐藥性相關(guān)通路（13個(gè)靶點(diǎn)參與）及P53信號(hào)通路（12個(gè)靶點(diǎn)參與）等。

根據(jù)本課題的研究?jī)?nèi)容，選取了腫瘤相關(guān)通路（pathways in cancer，hsa05200）、肝癌相關(guān)信號(hào)通路（hepatocellular carcinoma，hsa05225）、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路（apoptosis，hsa04210）、動(dòng)物細(xì)胞自噬信號(hào)通路（autophagy-animal，hsa04140）及動(dòng)物細(xì)胞線粒體自噬信號(hào)通路（mitophagy-animal，hsa04137）5條信號(hào)通路，利用KEGG考察了清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)參與以上信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)可以通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，并對(duì)肝癌細(xì)胞過(guò)度增殖、血管新生、基因組不穩(wěn)定、細(xì)胞分化阻遏及去分化狀態(tài)維持等細(xì)胞學(xué)行為進(jìn)行抑制。同時(shí)對(duì)肝細(xì)胞從氧化應(yīng)激脅迫、慢性炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝癌癌前病變、早期肝癌、中期肝癌及轉(zhuǎn)移型肝癌各個(gè)階段的細(xì)胞學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)可以對(duì)肝癌細(xì)胞的自噬，特別是線粒體自噬進(jìn)行有效調(diào)節(jié)。

2.4 苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生存率的影響

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選的治療肝癌主要有效成分的可靠性，首先查閱了本課題前期初步構(gòu)建的清肝化瘀顆粒指紋圖譜[9]，并在指紋圖譜中驗(yàn)證了槲皮素、木犀草素及苦參堿的存在。以上結(jié)果初步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選的清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要有效成分的預(yù)測(cè)結(jié)果。

苦參作為君藥在清肝化瘀顆粒組方中扮演著清熱燥濕、瀉火解毒的重要藥理學(xué)作用，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)苦參為清肝化瘀顆粒組方8味中藥中對(duì)應(yīng)有效成分?jǐn)?shù)目及靶點(diǎn)數(shù)目最多的君藥，而苦參堿則是對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目較多的有效成分之一，且在清肝化瘀顆粒組方中為苦參中獨(dú)有有效成分。既往研究也表明苦參及苦參堿在肝癌的治療中發(fā)揮重要的藥理學(xué)作用[18]。因此，推測(cè)苦參及苦參堿在清肝化瘀顆粒抗肝癌的作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用，為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要有效成分及分子機(jī)制的可靠性，本實(shí)驗(yàn)選取苦參堿作為主要有效成分代表進(jìn)行了細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。使用不同濃度的苦參堿處理HepG2細(xì)胞12 h后采用CCK-8實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞的生存率。結(jié)果表明，5、10 nmol/L苦參堿處理后，HepG2細(xì)胞的生存率分別為對(duì)照組的81.2%、62.4%，提示與對(duì)照組相比，苦參堿可以顯著降低HepG2細(xì)胞的生存率，且存在劑量相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明1 nmol/L苦參堿對(duì)于HepG2細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，生存率為對(duì)照組的98.3%，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異?？鄥A對(duì)HepG2細(xì)胞的最小抑制濃度為5 nmol/L。因此，選擇5 nmol/L劑量的苦參堿作為肝癌細(xì)胞模型后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理濃度。

圖3 清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點(diǎn)的GO-生物學(xué)過(guò)程分析(A)、GO-細(xì)胞組分分析(B)、GO-分子功能分析(C) 和KEGG富集分析(D)

2.5 苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)苦參堿處理肝癌HepG2細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的變化情況。結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組HepG2細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率為4.9%（圖4-A），5 nmol/L苦參堿處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比顯著提高，達(dá)到20.2%（圖4-C），而細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK處理可以顯著抑制苦參堿誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡，凋亡率下調(diào)至6.2%（圖4-D）。以上結(jié)果表明，苦參堿可以在肝癌HepG2細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體依賴的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。

A-對(duì)照組 B-z-VAD-FMK組 C-苦參堿組 D-苦參堿聯(lián)合z-VAD-FMK組

2.6 苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

使用苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞12 h后，利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為5 nmol/L的苦參堿處理后，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物GSH的濃度下調(diào)至23.9 nmol/mg（以蛋白量計(jì)，下同），而對(duì)照組中GSH的濃度為51.5 nmol/mg，提示苦參堿可以顯著下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞中GSH濃度。此外，5 nmol/L苦參堿處理后，另一種氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD的濃度下調(diào)至4.10 U/mg，而對(duì)照組SOD的濃度則為8.62 U/mg，提示苦參堿可以顯著下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞中SOD的水平。而濃度為1 nmol/L苦參堿處理的肝癌細(xì)胞中，氧化應(yīng)激標(biāo)志物無(wú)顯著變化（GSH濃度為49.4 nmol/mg，SOD濃度為8.40 U/mg）。這一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明苦參堿處理后，肝癌細(xì)胞模型中出現(xiàn)氧化應(yīng)激脅迫，而苦參堿誘導(dǎo)的線粒體依賴性細(xì)胞凋亡可能與氧化應(yīng)激脅迫環(huán)境的出現(xiàn)有關(guān)。

2.7 苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中VEGFA含量的影響

利用ELISA法檢測(cè)苦參堿處理肝癌HepG2細(xì)胞12 h后，其中VEGFA的含量變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，5 nmol/L苦參堿處理后，肝癌細(xì)胞HepG2中的VEGFA水平顯著下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為2.4倍，而濃度為1 nmol/L苦參堿在肝癌細(xì)胞中對(duì)VEGFA水平無(wú)影響。

2.8 苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中TP53及CCND1表達(dá)量的影響

利用Western blotting法檢測(cè)苦參堿處理12 h肝癌HepG2細(xì)胞中TP53及CCND1的表達(dá)量變化。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞在5、10 nmol/L苦參堿處理后TP53蛋白的表達(dá)量顯著提高（＜0.05），上調(diào)倍數(shù)分別為3.4倍與3.1倍；CCND1蛋白的表達(dá)量則顯著下調(diào)（＜0.01），下調(diào)幅度分別為83.9%、83.8%。而濃度為1 nmol/L苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中2種蛋白的表達(dá)量無(wú)影響。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

2.9 苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠瘤體積的影響

為了驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，本實(shí)驗(yàn)探究了苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠模型的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，給藥前對(duì)照組[（129.47±8.67）mm3]與苦參堿組[（129.73±7.51）mm3]中裸鼠瘤體積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥后，與對(duì)照組[（2 163.58±400.40）mm3]相比，苦參堿組[（1 286.45±210.10）mm3）]裸鼠瘤體積顯著減?。ǎ?.05），抑瘤率為40.5%（圖6-A）。此外，由腫瘤瘤體生長(zhǎng)曲線（圖6-B）可見(jiàn)，從14 d起，苦參堿延緩了裸鼠瘤體的生長(zhǎng)速度。

1～5-每組中肝癌荷瘤裸鼠編號(hào) 與對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.10 苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠瘤體病理組織學(xué)影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠模型的治療作用，對(duì)肝癌荷瘤裸鼠瘤體進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察。對(duì)照組瘤體可見(jiàn)完整的白色包膜，瘤體存在較多的出血及壞死組織；苦參堿組瘤體體積顯著小于對(duì)照組，出血組織及壞死組織少于對(duì)照組。鏡下可見(jiàn)對(duì)照組肝癌組織一系列病理變化，如肝細(xì)胞索紊亂，細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞核體積變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物增多，深核染色以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。與對(duì)照組相比，苦參堿組上述病理改變顯著減輕（圖7）。

2.11 苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠瘤體細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡行為的調(diào)控，利用TUNEL染色法對(duì)苦參堿處理后肝癌荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)肝癌細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行了檢測(cè)。如圖8所示，與對(duì)照組相比，苦參堿處理后肝癌荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增多。

2.12 苦參堿對(duì)肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子的調(diào)節(jié)作用

以線粒體自噬及線粒體分裂為代表的線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制與在腫瘤細(xì)胞中被廣泛抑制的線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡存在相互調(diào)節(jié)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)苦參堿可以在HepG2細(xì)胞中通過(guò)抑制PINK1/Parkin通路相關(guān)的線粒體自噬及激活MST1/JNK通路相關(guān)的線粒體分裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，抑制肝癌細(xì)胞增殖[19-20]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果也表明清肝化瘀顆粒及其有效成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬，并通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞學(xué)行為發(fā)揮抑制肝癌的作用，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化及Western blotting驗(yàn)證了苦參堿給藥后肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子的表達(dá)水平變化。如圖9所示，免疫組化染色顯示對(duì)照組瘤體MST1陽(yáng)性細(xì)胞率為（27.90±5.51）%，苦參堿組瘤體MST1陽(yáng)性細(xì)胞率為（45.92±8.62）%，與對(duì)照組相比顯著提高（＜0.01）；此外，對(duì)照組瘤體Parkin陽(yáng)性細(xì)胞率為（41.50±3.80）%，苦參堿組瘤體Parkin陽(yáng)性細(xì)胞率為（33.69±2.98）%，與對(duì)照組相比顯著降低（＜0.05）。Western blotting結(jié)果驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果，如圖10所示，苦參堿給藥后線粒體分裂相關(guān)蛋白MST1及p-JNK表達(dá)量較對(duì)照組顯著提高（＜0.01），MST1、p-JNK上調(diào)倍數(shù)分別為2.1倍和5.2倍；而線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1及Parkin在苦參堿給藥后表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下調(diào)，PINK1下調(diào)62.9%（＜0.01），Parkin下調(diào)40.2%（＜0.05）。以上結(jié)果提示苦參堿可以在肝癌動(dòng)物模型中對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖7 裸鼠瘤體病理切片(HE染色，×400)

圖8 TUNEL法檢測(cè)肝癌荷瘤裸鼠瘤體細(xì)胞凋亡情況(×400)

圖9 免疫組化法檢測(cè)肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子表達(dá)情況(×400)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3 討論

本研究從清肝化瘀方8味中藥中發(fā)現(xiàn)了可以作用于肝癌治療靶點(diǎn)蛋白的136種有效成分，其中槲皮素、木犀草素、苦參堿為對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與信號(hào)通路數(shù)量較多的有效成分，同時(shí)這幾種有效成分也為清肝化瘀顆粒組方中君藥和臣藥的主要藥效成分，且具有較好的口服利用度與成藥性，這一結(jié)果從主要成分的層次說(shuō)明了清肝化瘀顆粒配伍嚴(yán)謹(jǐn)，君臣佐使搭配精妙，處方遣方用藥合理科學(xué)。既往研究發(fā)現(xiàn)這3種化合物具有較好的抗腫瘤活性。Salama等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)調(diào)節(jié)酪蛋白激酶2α（Casein kinase 2α，CK2α）/cyclin D1的表達(dá)量阻遏肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)p53/Caspase-3信號(hào)通路解除肝癌細(xì)胞凋亡的抑制進(jìn)而下調(diào)肝癌細(xì)胞的增殖水平。研究人員發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以誘導(dǎo)肝癌Hep3B細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與的細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制其細(xì)胞增殖水平[22]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)苦參堿可以通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡與自噬的相互調(diào)節(jié)對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性增殖進(jìn)行抑制[23]。

本研究也利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了苦參堿對(duì)于肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中評(píng)分較高的靶點(diǎn)蛋白也是槲皮素、木犀草素及苦參堿的靶點(diǎn)蛋白，并可以富集到多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)途徑中。因此，推測(cè)以槲皮素、木犀草素、苦參堿為代表的3種主要成分在清肝化瘀顆粒治療肝癌中發(fā)揮主導(dǎo)作用。這為從有效單體成分水平研究清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用提供了依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具發(fā)現(xiàn)TP53、CCND1及VEGFA為清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白。TP53是人體中最重要的抑癌蛋白，其可在多種惡性腫瘤中起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。P53信號(hào)通路的活性抑制可以在肝癌細(xì)胞中維持惡性增殖、凋亡抑制及侵襲轉(zhuǎn)移等多種腫瘤細(xì)胞學(xué)行為的激活，進(jìn)而對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展提供機(jī)會(huì)[24]。CCND1是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可以對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶進(jìn)行調(diào)節(jié)并參與G1期向S期的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。CCND1參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明CCND1可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、肝癌干細(xì)胞干性維持及化療藥物耐藥性形成等腫瘤細(xì)胞學(xué)行為發(fā)揮促進(jìn)作用[25]。VEGFA為生長(zhǎng)因子家族的成員，其在許多腫瘤組織中表達(dá)量上調(diào)并與腫瘤分期及進(jìn)展相關(guān)，既往研究表明，其在肝癌中可以在氧化應(yīng)激脅迫下誘導(dǎo)促癌炎癥微環(huán)境形成，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移與免疫逃逸，同時(shí)抑制肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而引起肝癌細(xì)胞惡性增殖[26]。本研究利用基因功能富集分析結(jié)果顯示，TP53、CCND1及VEGFA可以參與細(xì)胞凋亡通路、氧化應(yīng)激脅迫相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路及細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具同時(shí)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自清肝化瘀顆粒組方中藥的多種有效成分可與這3種靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)苦參堿對(duì)這3種靶點(diǎn)蛋白的調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果說(shuō)明TP53、CCND1及VEGFA可以作為核心靶點(diǎn)在清肝化瘀顆粒對(duì)肝癌的治療中發(fā)揮著重要作用，為從靶點(diǎn)水平上闡釋清肝化瘀顆粒治療肝癌的分子學(xué)機(jī)制提供了依據(jù)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種蛋白分子、多條信號(hào)通路對(duì)多種細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)的結(jié)果。而中醫(yī)藥對(duì)疾病多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路，整體性的治療方式在腫瘤的治療中具有極大優(yōu)勢(shì)。本研究對(duì)獲得的清肝化瘀顆粒治療肝癌的靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)其治療肝癌的靶點(diǎn)蛋白可以富集到包括磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase-Akt，PI3K-Akt）信號(hào)通路，P53信號(hào)通路及JAK激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號(hào)通路等與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，基因富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)基因可以定位于肝癌細(xì)胞的各個(gè)組分，并在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)促炎微環(huán)境形成、氧化應(yīng)激脅迫、代謝重編程、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡進(jìn)程以及侵襲轉(zhuǎn)移等肝癌細(xì)胞生物學(xué)調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮重要作用。線粒體作為整合細(xì)胞能量代謝、物質(zhì)代謝和生命信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞器，在細(xì)胞的環(huán)境適應(yīng)與存活作用中不可或缺[27]。因此，線粒體的功能與自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物治療腫瘤的效果至關(guān)重要，線粒體的生物發(fā)生、裂變與融合、新陳代謝與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)，線粒體自噬及線粒體參與的細(xì)胞凋亡等生物學(xué)事件都在腫瘤細(xì)胞的存活與死亡中扮演重要角色，其在腫瘤靶向治療中也發(fā)揮著重要作用[28]。本研究利用苦參堿治療HepG2肝癌荷瘤裸鼠后發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以在肝癌細(xì)胞中通過(guò)PINK1/Parkin信號(hào)通路與MST1-JNK信號(hào)途徑對(duì)線粒體自穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并重新激活被抑制的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激脅迫及細(xì)胞凋亡進(jìn)程。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)清肝化瘀方含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制與線粒體參與的代謝重編程、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖等肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[29]。以上研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明清肝化瘀顆粒組方可以通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路對(duì)肝癌的多種生物學(xué)行為進(jìn)行抑制，苦參堿在其中可以作為主要有效成分發(fā)揮作用，此外作為細(xì)胞生命活動(dòng)，新陳代謝途徑及信號(hào)通路的交匯中心，線粒體在清肝化瘀顆粒抑制肝癌的作用中發(fā)揮著重要作用。

肝癌在中醫(yī)屬“肝積”“癥積”“鼓脹”“脅痛”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，由于機(jī)體正氣虛弱，外感邪毒；或情志抑郁，氣滯血瘀；或脾失健運(yùn)，濕濁內(nèi)生，終致濕濁瘀毒結(jié)于臟腑所致。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》及國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《肝癌中醫(yī)診療方案》，肝癌從發(fā)病到進(jìn)展等各個(gè)時(shí)期的臨床表現(xiàn)可辨證分型為“肝膽濕熱證”及“肝熱血瘀證”等5種[6]。針對(duì)肝癌的這些辨證分型也符合現(xiàn)代人因過(guò)度進(jìn)食高蛋白、高脂肪的飲食，進(jìn)而影響脾胃運(yùn)化，積聚而生濕濁的肝癌病因[7]；也符合惡性腫瘤患者氣血不足甚至氣血衰敗，癥積日久進(jìn)而瘀阻血脈造成的氣血運(yùn)行不暢等臨床表現(xiàn)[8]。研究表明，濕熱證可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)，影響代謝及腸道微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，清熱燥濕類中藥可發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)血糖血脂等作用。清肝化瘀顆粒是由苦參、黃芩等8味中藥組成，具有清熱解毒、化瘀散結(jié)、健脾益氣之功。其中苦參、黃芩作為君藥，可清熱燥濕、瀉火解毒；白術(shù)、莪術(shù)作為臣藥，可健脾和胃、活血化瘀；臣藥之中另外2味為半枝蓮及白花蛇舌草，有加強(qiáng)清熱解毒及抗癌作用，輔以消腫散結(jié)的功效；三棱為佐藥，可以增強(qiáng)活血化瘀、軟堅(jiān)消癥的藥效；使藥為甘草，有解毒扶正、益氣且調(diào)和諸藥的作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)清肝化瘀顆粒組方中藥可對(duì)細(xì)胞凋亡、代謝重編程、促癌炎癥微環(huán)境、血管新生與侵襲轉(zhuǎn)移等多種肝癌細(xì)胞學(xué)行為發(fā)揮作用。而改善炎癥微環(huán)境、降低氧化應(yīng)激脅迫、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及阻止血管新生可能是清肝化瘀顆粒發(fā)揮清熱解毒、破瘀散結(jié)功效的主要分子機(jī)制。既往研究也發(fā)現(xiàn)，清肝化瘀方可以通過(guò)改變VEGFA信號(hào)通路，抑制肝癌模型大鼠的血管新生和侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮肝癌抑制作用[30]，基于清肝化瘀方聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞的肝癌臨床研究也得到了類似的結(jié)論[31]?；谝陨蟼鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)2個(gè)角度的研究結(jié)果，推測(cè)清肝化瘀顆?？梢酝ㄟ^(guò)組方中藥中的多種有效成分，對(duì)多靶點(diǎn)、多通路、多生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)現(xiàn)代人群中濕熱型肝癌發(fā)揮治療作用，而改善炎癥微環(huán)境、降低氧化應(yīng)激脅迫、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及阻止血管新生可能是清肝化瘀顆粒發(fā)揮清熱解毒、破瘀散結(jié)功效的主要分子機(jī)制。

本研究為中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)及新思路，也為傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的現(xiàn)代化奠定了基礎(chǔ)。為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究所得出的結(jié)果，利用分子細(xì)胞生物學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)本研究預(yù)測(cè)的有效成分、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路及細(xì)胞生物學(xué)行為開(kāi)展深入研究，以期為祖國(guó)醫(yī)學(xué)在肝癌治療中的應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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An exploration on mechanisms of Qinggan Huayu Granule in treating liver cancer based on network pharmacology

CAO Jian1, ZHU Xiao-ran2, YANG Zhen-huan2, SUO Fei-ya2, YAO Shu-kun1, 2, 3

1. School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Department of Gastroenterology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

To investigate the main active compounds, molecular target genes, and target signal pathways of Qinggan Huayu Granule (清肝化瘀顆粒) treating liver cancer.Based on multiple traditional Chinese medicine and disease databases, the network pharmacology tool was used to screen the main active compounds and action targets of Qinggan Huayu Granule treating liver cancer, analyze the biological functions of potential targets, and construct a network of “herb-ingredient-target-disease”. Theandexperiment was used to verify the effect of matrine, the core component of Qinggan Huayu Granule, on cytological behaviors of liver cancer cells. The regulation of matrine on the candidate target protein was also detected.A total of 86 potential targets for the treatment of liver cancer were screened by traditional Chinese medicine and disease databases. Through enrichment analysis of potential targets, there were 20 biological processes, 15 cellular components, 20 molecular functions, and 20 signaling pathways were yielded. Using “herb-ingredient-target-disease” network, it was found that Qinggan Huayu Granule regulated the biological behaviors of tumors related to liver cancer, such as apoptosis and autophagy, by mainly targets tumor protein p53 (TP53), vascular endothelial growth factor A (VEGFA), G1/S-specific cyclin-D1(CCND1), and other hub genes through quercetin, luteolin, matrine and other active ingredients.experiments revealed that matrine could inhibit cell proliferation, promote apoptosis, and modulate the levels of molecular markers of oxidative stress in a dose-dependent manner in liver cancer cell model. At the same time, matrine can regulate expression of TP53, VEGFA, and CCND1 in protein level.experiments showed that matrine had a tumor suppression effect on HepG2 xenograft tumors in nude mice, and induced apoptosis of liver cancer cells. Meanwhile, matrine regulated the expression in protein levels of mitophagy and mitochondrial fission related molecules.The main mechanism of Qinggan Huayu Granule in treating liver cancer was related to systematic synergy effect of multiple compounds as represented by quercetin, luteolin and matrine, multiple targets as represented by TP53, VEGFA and CCND1, multiple signal pathways as presented by the regulation effects of apoptosis, mitochondrial homeostasis and oxidative stress.

network pharmacology; Qinggan Huayu Granule; liver cancer; matrine; molecular mechanism; quercetin; luteolin

R285

A

0253 - 2670(2021)07 - 2039 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.021

2020-08-13

北京市科委G20工程創(chuàng)新研究十病十藥研發(fā)項(xiàng)目（Z171100001717008）

曹 建（1990—），男，博士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴巻误w抗腫瘤機(jī)制。Tel: (010)84206160 E-mail: caojian120@163.com

姚樹(shù)坤，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合抗肝癌的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: shukun_yao@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]