李海寧，鄭瑞芳，都研文，王 文，孫芳玲，劉砥威，邢建國(guó)*

田薊苷抗腦缺血再灌注程序性壞死的作用及機(jī)制研究

李海寧1，鄭瑞芳2，都研文2，王 文3，孫芳玲3，劉砥威2，邢建國(guó)2*

1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000 2. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830002 3. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053

研究田薊苷抗腦缺血再灌注損傷程序性壞死的作用及機(jī)制。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y用Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理16 h后缺氧培養(yǎng)6 h、復(fù)氧培養(yǎng)2 h建立腦缺血再灌注程序性壞死模型，在缺氧前6 h給予田薊苷進(jìn)行干預(yù)。采用Hoechst33342/PI染色檢測(cè)壞死細(xì)胞數(shù)目；采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平及細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的變化；采用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化；采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞程序性壞死通路相關(guān)蛋白如受體相互作用蛋白3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）、混合系結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）、磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase family 5，PGAM5）表達(dá)情況。與模型組比較，田薊苷組細(xì)胞存活率顯著提高（＜0.05）；細(xì)胞上清中LDH活性和IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（＜0.05）；細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（＜0.05）；細(xì)胞線粒體膜電位顯著升高（＜0.05），mPTP開(kāi)放被顯著抑制（＜0.05）；細(xì)胞RIPK3、MLKL、CaMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05）。田薊苷可能通過(guò)抑制程序性壞死途徑，保護(hù)線粒體，從而發(fā)揮抑制腦缺血再灌注損傷的作用。

田薊苷；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；程序性壞死；線粒體；受體相互作用蛋白3

腦缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥和氧化應(yīng)激，從而加劇缺血損傷[1]。細(xì)胞死亡為腦缺血再灌注損傷發(fā)生的主要事件之一。以往研究多集中于細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞程序性壞死是一種不同于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡方式，具有壞死樣結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，受細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)分子調(diào)控[2-4]。抑制程序性壞死通路后，大部分缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受到抑制[5]。因此，腦缺血再灌注損傷后程序性壞死相關(guān)通路的激活是治療腦缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)[6]。當(dāng)程序性壞死發(fā)生時(shí)，受體相互作用蛋白3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）作為程序性壞死關(guān)鍵調(diào)控蛋白，使混合系結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）被磷酸化和寡聚化，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞膜破裂[7-8]。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKII）是RIPK3的底物，CaMKⅡ被RIPK3磷酸化后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）大量開(kāi)放，線粒體受損，加劇炎癥反應(yīng)[9]。

田薊苷是新疆民族藥香青蘭中的主要活性成分[10]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，田薊苷可以促進(jìn)腦血管新生，對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦組織具有一定保護(hù)作用，可以通過(guò)調(diào)控活性氧（reactive oxygen species，ROS）/CaMKⅡ通路，抑制線粒體損傷，并抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y死亡[11-12]。本研究首先從調(diào)控RIPK3通路抑制程序性壞死角度來(lái)探討田薊苷抗腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制，為其治療腦缺血再灌注損傷提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

SH-SY5Y細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)生物研究所惠贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑

田薊苷（批號(hào)20170805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所自制；胎牛血清（批號(hào)10099-141C）、無(wú)糖培養(yǎng)基（批號(hào)119660225）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰酶（批號(hào)SH3004201）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)SH30022.01）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；厭氧袋（批號(hào)C-1）購(gòu)自日本三菱公司；Caspase抑制劑Z-VAD-FMK（批號(hào)s702304）購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)AR1160-500）、磷酸酶抑制劑（批號(hào)AR1183）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0016）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（批號(hào)P0012AC）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)23227）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；DCFH-DA活性氧熒光探針（批號(hào)CA1410）、RIPA裂解液（批號(hào)R0010）、蛋白酶抑制劑PMSF（批號(hào)P0100）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號(hào)SEKH-0002）、IL-6試劑盒（批號(hào)SEKH-0047）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)SEKH-0013）、線粒體膜電位試劑盒（批號(hào)M8650）購(gòu)自北京索萊寶生化試劑有限公司；mPTP檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BB-48122）購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；蛋白marker（批號(hào)26616）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RIPK3抗體（ab62344）、MLKL抗體（批號(hào)ab255747）、CaMKⅡ抗體（批號(hào)ab22609）、磷酸化CaMKⅡ（p-CaMKⅡ）抗體（批號(hào)ab182647）、磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase family 5，PGAM5）抗體（批號(hào)ab126534）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷酸化MLKL（p-MLKL）抗體（批號(hào)91689）購(gòu)自美國(guó)CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)TA-08）、IgG/辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（批號(hào)ZB-2305）、IgG/辣根酶標(biāo)記山羊抗兔抗體（批號(hào)ZB-2301）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液（批號(hào)WBKLS0500）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3 儀器

HERA cell-150i細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SPARK多功能微孔板檢測(cè)儀（瑞士Tecan公司）；FUSION FX6多功能成像系統(tǒng)購(gòu)自（法國(guó)Vilber公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；TGL-16K離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；熒光顯微鏡（美國(guó)invitrogen公司）。

2 方法

2.1 藥物配制

田薊苷和Z-VAD-FMK分別溶于DMSO，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 Z-VAD-FMK對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞程序性壞死的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和Z-VAD-FMK組。Z-VAD-FMK組加入藥物（Z-VAD-FMK母液以DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組和模型組加入不含藥物的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h。棄去培養(yǎng)基，Z-VAD-FMK組加入藥物（Z-VAD-FMK母液以無(wú)糖培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組和模型組加入不含藥物的無(wú)糖培養(yǎng)基，對(duì)照組正常培養(yǎng)8 h；將模型組和Z-VAD-FMK組的96孔板置于缺氧盒中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；打開(kāi)缺氧盒，取出96孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。模型組和Z-VAD-FMK組缺氧培養(yǎng)6 h，復(fù)氧培養(yǎng)2 h。按照Hoechst 33342/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)壞死細(xì)胞

2.4 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以6×104/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和田薊苷組（2.5、5.0、10.0 μg/mL），除對(duì)照組外，各組加入以DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋的Z-VAD-FMK，培養(yǎng)10 h后，田薊苷組加入不同質(zhì)量濃度的藥物（田薊苷母液以DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組和模型組加入不含藥物的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基，除對(duì)照組外，其余各組加入以無(wú)糖培養(yǎng)基稀釋的Z-VAD-FMK，田薊苷組另加入不同質(zhì)量濃度的藥物（田薊苷母液以無(wú)糖培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組和模型組加入不含藥物的無(wú)糖培養(yǎng)基，對(duì)照組正常培養(yǎng)8 h；模型組和給藥組缺氧培養(yǎng)6 h，復(fù)氧培養(yǎng)2 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h，采用多功能微孔板檢測(cè)儀于450 nm處測(cè)定吸光度（）值。

2.5 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞上清中LDH活性的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，取上清，400×離心5 min，取120 μL至96孔板中，加入60 μL LDH工作液，混勻，室溫避光孵育30 min，采用多功能微孔板檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)定值。

2.6 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入DCFH-DA，于37 ℃孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，采用多功能微孔板檢測(cè)儀于488 nm處測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm處測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)。熒光強(qiáng)度與ROS水平呈正相關(guān)。

2.7 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞上清液中炎性因子水平的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，取上清液離心，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

2.8 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入1 mL培養(yǎng)基和1 mL線粒體膜電位染色工作液，混勻，于37 ℃孵育20 min，棄上清，用線粒體膜電位染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。線粒體膜電位較高時(shí)，產(chǎn)生紅色熒光；線粒體膜電位較低時(shí)，產(chǎn)生綠色熒光。

2.9 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體mPTP的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，使用HBSS緩沖液重懸，制成密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液。取500 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL染色工作液，混勻后，于37 ℃避光孵育15 min；模型組和給藥組加入5 μL熒光淬滅劑，混勻，于37 ℃避光孵育15 min，1000×離心5 min，收集細(xì)胞，使用HBSS緩沖液重懸細(xì)胞，采用多功能微孔板檢測(cè)儀于488 nm處測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm處測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)。mPTP開(kāi)放時(shí)，熒光淬滅劑進(jìn)入線粒體，熒光強(qiáng)度變?nèi)酢?/p>

2.10 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h。按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入含PMSF和磷酸酶抑制劑的裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入RIPK3、MLKL、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、PGAM5、p-MLKL、GAPDH抗體，孵育過(guò)夜，加入IgG/辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔抗體，孵育，加入ECL顯影，采用多功能成像系統(tǒng)采集圖像并用Image J軟件分析。

2.11 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 Z-VAD-FMK對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞程序性壞死的影響

如圖1所示，PI將處于壞死的細(xì)胞染為紅色，正常細(xì)胞和中早期凋亡細(xì)胞則被Hoechst著色為藍(lán)色。與模型組比較，Z-VAD-FMK顯著促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞壞死（＜0.05）。

與模型組比較：*P＜0.05

3.2 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率和上清中LDH活性的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.05），上清中LDH活性顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，田薊苷組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05），上清中LDH活性顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

3.3 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ROS水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，田薊苷組細(xì)胞ROS水平顯著降低（＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。

3.4 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞上清液中炎性因子水平的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，田薊苷（2.5 μg/mL）組細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6水平顯著降低（＜0.05），田薊苷（5、10 μg/mL）組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05）。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，下圖同

圖3 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響 ()

3.5 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位和mPTP的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體熒光強(qiáng)度均顯著降低（＜0.05），表明mPTP開(kāi)放；與模型組比較，田薊苷組細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體熒光強(qiáng)度顯著升高（＜0.05）。

3.6 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞RIPK3、MLKL、CaMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞RIPK3、p-MLKL/MLKL、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，田薊苷（2.5 μg/mL）組細(xì)胞p-MLKL/MLKL、p-CaMKⅡ/ CaMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），田薊苷（5、10 μg/mL）組細(xì)胞RIPK3、p-MLKL/ MLKL、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05）。

圖4 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞上清液中IL-1β (A)、IL-6 (B)和TNF-α (C)水平的影響()

圖5 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位 (A、B) 和mPTP (C) 的影響 ()

圖6 田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞RIPK3、MLKL、CaMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)的影響()

4 討論

與細(xì)胞凋亡不同，程序性壞死過(guò)程不涉及關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子。程序性壞死過(guò)程中，死亡細(xì)胞的形態(tài)如早期喪失漿膜完整性、缺乏核碎裂、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激與細(xì)胞壞死類似[3]。多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的發(fā)病機(jī)制均涉及程序性壞死，通過(guò)干預(yù)程序性壞死信號(hào)通路，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷尤其是腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[13-15]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮能夠保護(hù)阿霉素?fù)p傷的心肌細(xì)胞[16]；其中的單體成分田薊苷可以有效抑制糖氧剝奪后細(xì)胞中CaMKⅡ依賴性線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子- κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥通路的激活，對(duì)高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化大鼠具有顯著改善作用，并對(duì)心肌和大腦缺血再灌注損傷有顯著保護(hù)作用[11-12]。因此，田薊苷在心腦血管疾病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。

程序性壞死是在凋亡執(zhí)行被阻止的情況下，凋亡受體的死亡結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)的壞死性細(xì)胞死亡[7-8]。在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基礎(chǔ)上，使用Caspase抑制劑Z-VAD-FMK進(jìn)行干預(yù)，可以使細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[17]?；谇捌谘芯浚狙芯坎捎萌毖? h、復(fù)氧2 h的方法模擬缺血再灌注腦損傷，聯(lián)合Z-VAD-FMK誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞壞死細(xì)胞顯著升高，上清液中LDH活性和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，線粒體膜電位降低、mPTP開(kāi)放，表明模型建立成功；田薊苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞程序性壞死具有保護(hù)作用。

在程序性壞死細(xì)胞中，RIPK3可直接磷酸化MLKL的第357位蘇氨酸和第358位絲氨酸，p-MLKL可作為程序性壞死的特異性標(biāo)志物[7]。MLKL能夠誘導(dǎo)線粒體絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（PGAM5），從而導(dǎo)致線粒體損傷，如線粒體膜電位降低、線粒體通道開(kāi)放等[8]。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)了由RIPK3-CaMKⅡ通路介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞壞死機(jī)制，RIPK3-CaMKⅡ通路激活后，RIPK3通過(guò)激活CaMKⅡ，造成心肌細(xì)胞的程序性壞死及繼發(fā)的惡性心臟重構(gòu)和心力衰竭。程序性壞死通路激活后，MLKL能夠與線粒體損傷相關(guān)蛋白PGAM5結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞RIPK3、p-MLKL、p-CAMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)水平均顯著升高，田薊苷組細(xì)胞RIPK3、p-MLKL、p-CAMKⅡ和PGAM5蛋白表達(dá)水平均顯著降低，表明田薊苷可能通過(guò)抑制程序性壞死通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞。

程序性壞死發(fā)生后，大量釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子，加重腦損傷[18-19]。敲除RIPK3的小鼠發(fā)生程序性壞死后，炎癥反應(yīng)得到明顯改善，表明程序性壞死發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)容物的釋放是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的主要原因，抑制RIPK3可以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[20]。本研究結(jié)果顯示，田薊苷組細(xì)胞上清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低，表明田薊苷能夠減輕發(fā)生程序性壞死后SH-SY5Y細(xì)胞的損傷。

綜上所述，田薊苷能夠提高缺氧復(fù)氧損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力，其機(jī)制可能與保護(hù)細(xì)胞線粒體、調(diào)節(jié)程序性壞死通路蛋白R(shí)IPK3及其下游MLKL、CaMKⅡ的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of tilianin against necroptosis on cerebral ischemia- reperfusion

LI Hai-ning1, ZHENG Rui-fang2, DU Yan-wen2, WANG Wen3, SUN Fang-ling3, LIU Di-wei2, XING Jian-guo2

1. College of Pharmacy , Shihezi University, Shihezi 832000, China 2. Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi 830002, China 3. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China

To study the effect and mechanism of tilianin against programmed necrosis of cerebral ischemia-reperfusion injury.Human neuroblastoma cells SH-SY5Y were pretreated with Caspase inhibitor Z-VAD-FMK for 16 h, then cultured under hypoxia for 6 h and reoxygenated for 2 h to establish a model of programmed cerebral ischemia-reperfusion necrosis. Tilianin was given for intervention 6 h before hypoxia. Hoechst33342/PI staining was used to detect the number of necrotic cells; CCK-8 method was used to detect cell viability; ELISA method was used to detect lactate dehydrogenase (LDH) activity and interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels in supernatant, intracellular reactive oxygen species (ROS) level and mitochondrial permeability transition pore (mPTP) changes in SH-SY5Y cells; Fluorescence microscopy was used to detect changes in cell mitochondrial membrane potential; Western blotting was used to detect expressions of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), mixed-line domain-like proteins (MLKL), calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ (CaMKⅡ) and phosphoglycerate mutase family 5 (PGAM5).Compared with model group, cell viability of tilianin group was significantly increased (< 0.05); LDH activity and levels of IL-1β, IL-6, TNF-α in supernatant were significantly decreased (< 0.05); ROS level were significantly reduced (< 0.05); Cell mitochondrial membrane potential was significantly increased (< 0.05); Mitochondrial membrane permeability transition pore (mPTP) opening was significantly inhibited (< 0.05); Expressions of RIPK3, MLKL, CaMKⅡ and PGAM5 were significantly decreased (< 0.05).Tilianin may protect mitochondria by inhibiting programmed necrosis pathway, thereby inhibiting cerebral ischemia-reperfusion injury.

tilianin; SH-SY5Y cells; necroptosis; mitochondria; receptor interacting protein kinase 3

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07 - 1974 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.014

2020-10-26

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（青年基金）資助項(xiàng)目（2020D01B50）；新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（KY2020086）；2019年新疆維吾爾自治區(qū)高層次人才引進(jìn)工程（柔性引進(jìn)人才）項(xiàng)目

李海寧（1994—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镏苽浼百|(zhì)量控制。Tel: 15726069394 E-mail: lhnmiku@163.com

邢建國(guó)（1968—），男，研究員，從事中藥民族藥新制劑與新劑型研究。Tel: 13999178585 E-mail: xjguodd@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]