安麗麗，孫賀軍#，孔永紅，王新明，趙成龍

具有線粒體靶向功能的穿心蓮內酯TPP-PEG-PE脂質體的制備及其作用于胃癌模型小鼠的機制研究

安麗麗1，孫賀軍1#，孔永紅1，王新明1，趙成龍2, 3*

1. 駐馬店市中心醫(yī)院 藥學部，河南 駐馬店 463000 2. 河南省人民醫(yī)院 消化內科，河南 鄭州 454002 3. 河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004

制備穿心蓮內酯（andrographolide，AP）(3-丙羧基)三苯基溴化膦［(3-carboxy propyl) triphenylphosph-onium bromide，TPP］-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乙烯（polyethylene，PE）脂質體（AP@TPP-PEG-PE#Lips），研究其體外釋放、溶血性、線粒體靶向性、促胃癌細胞凋亡和作用胃癌模型小鼠的機制。采用薄膜水化法制備AP@TPP-PEG-PE#Lips，檢測該脂質體的粒徑、電勢、顯微電鏡形態(tài)、穩(wěn)定性、溶血性及體外釋放情況；流式細胞儀測定胃癌細胞對脂質體的攝取情況，激光共聚焦顯微鏡研究其在線粒體的靶向性；評價AP@TPP-PEG-PE#Lips對胃癌細胞凋亡和胃癌模型小鼠的影響。AP@TPP-PEG-PE#Lips粒徑為（23.8±1.7）nm，Zeta電位為（30.2±1.1）mV，分布較為均勻，規(guī)則球形結構；體外試驗表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips溶血率低、緩釋性能和血液相容性好；熒光試驗結果顯示，TPP-PEG- PE#Lips可以促進藥物的細胞攝取；AP@TPP-PEG-PE# Lips作用胃癌細胞和胃癌模型小鼠結果顯示，AP@TPP-PEG-PE#Lips可以明顯降低胃癌細胞線粒體膜電位，增加細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，促進半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的釋放，增加促凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和減少抗凋亡蛋白Bcl2-associated X（Bax）的表達。AP@TPP-PEG-PE#Lips可以有效的將藥物遞送到線粒體，增強藥物促腫瘤細胞凋亡作用。

線粒體靶向；穿心蓮內酯；TPP-PEG-PE；脂質體；細胞攝取；胃癌；體外釋放；溶血性；細胞凋亡；薄膜水化法；活性氧；Caspase-3；Bcl-2；Bax

穿心蓮(Burm. f.) Nees是爵床科的藥用植物，也稱為“苦味之王”，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[1-2]。穿心蓮內酯（andrographolide，AP）是從穿心蓮中提取的二萜內酯類化合物。近年來，研究發(fā)現(xiàn)AP可以抑制多種腫瘤細胞的增殖，具有抗癌活性[3-4]。劉奇章等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AP對胃癌SGC7901細胞具有很好的抑制作用，該成分通過線粒體途徑誘導胃癌細胞凋亡，上調Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達，下調抑凋亡蛋白Bcl-2表達；另外，還可以通過上調細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，促使線粒體膜電位崩潰，抑制胃癌SGC7901細胞的生長。盡管如此，但AP存在水溶性和脂溶性均差的成藥性問題，藥物遞送效率不高，嚴重限制了AP在制藥領域內的發(fā)展[6]。因此，開發(fā)一種新型藥物載體解決AP的成藥性問題具有重要意義。脂質體是目前研究比較熱門的新型藥物遞送系統(tǒng)。它由脂質雙分子層組成，內部為閉合囊泡，可包載親水性和親脂性藥物，具有優(yōu)良的生物相容性和水溶性，并且很容易通過各種修飾，提高藥物的靶向性。目前，已經(jīng)廣泛應用于腫瘤藥物的靶向遞送[7-8]。(3-丙羧基)三苯基溴化膦［(3-carboxy propyl) triphenylphosph-onium bromide，TPP］陽離子呈正電荷性質，常用來介導腫瘤藥物載體靶向遞送至線粒體，提高藥物的療效[9-11]。因此，本實驗采用TPP陽離子修飾脂質體，擬將AP遞送到胃癌細胞線粒體，精確調節(jié)線粒體功能，明顯增強藥物促腫瘤細胞凋亡效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

NS-3500激光掃描共聚焦顯微鏡購于北京美亞先科技有限公司；Zetasizer Nano ZSP納米粒度電勢儀購于英國馬爾文公司；FA1004B電子分析天平購于上海精密儀器儀表有限公司；JEM-2100透射電子顯微鏡（TEM）購于日本電子株式會社；XPN-100臺式高速離心機購于貝克曼庫爾特公司。

1.2 藥品與試劑

AP購自四川洪恩植物科技有限公司，批號20191104，質量分數(shù)≥98%；TPP-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乙烯（polyethylene，PE）相對分子質量約2500，批號20191205，PEG-PE相對分子質量約2000，批號20191103，質量分數(shù) 均≥90%，PDI均＜0.3，均購買于西安瑞禧生物科技有限公司；大豆磷脂，批號20191109，購買于上海太偉藥業(yè)有限公司；膽固醇，批號20191205，購買于成都科龍生化公司；DID紅色熒光染料購自西安百螢生物科技有限公司，批號20191109，質量分數(shù)≥98%；線粒體綠色熒光染料（MitoTrackerTMGreen）和細胞核Hoechst 33258染料購自南京沃博生物科技有限公司；色譜甲醇和乙腈購自美國Fisher化學試劑公司；Caspase-3活性檢測試劑盒購買于濟南碧云天生物公司，批號C1115。

1.3 細胞株與動物

胃癌SGC7901細胞、MKN45細胞和胃黏膜上皮GES-1細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所；DMEM培養(yǎng)基（高糖）購自美國Thermo Fisher公司；Gibco 16000-044胎牛血清（特級FBS）購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

SPF級BALB/C裸鼠，雄性，4～5周齡，購買于中科院上海細胞生物學研究所。所有動物實驗遵循河南駐馬店市中心醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 方法與結果

2.1 穿心蓮內酯TPP-PEG-PE脂質體（AP@TPP- PEG-PE#Lips）的制備及特征性分析

2.1.1 AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips的制備 精密稱取大豆磷脂200 mg，膽固醇20.1 mg，TPP-PEG-PE或PEG-PE 17.2 mg，AP 30 mg，將以上材料和藥物共同溶解于適量體積的混合溶劑［氯仿-甲醇（2∶1）］中[12]，充分溶解后，置于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮成膜。真空冷凍條件下干燥5 h，除去殘留有機溶劑。加入適量的pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），于37 ℃、200 r/min搖床中避光水化1 h；水浴超聲5 min，使脂質膜從瓶壁上完全脫落；0.22 μm微孔濾膜3～5次，即得粒徑均勻分布的脂質體AP@TPP-PEG-PE# Lips和AP@PEG-PE#Lips，備用。

2.1.2 粒徑分布和Zeta電位測定 以移液槍吸取少許AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips，加入適量蒸餾水稀釋，采用Zetasizer Nano ZS納米粒度電勢儀測定粒徑、Zeta電位分布，結果如圖1所示。AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips的粒徑分別為（23.8±1.7）、（20.3±1.5）nm；分布較為均勻，PDI分別為0.242±0.011、0.237±0.010；Zeta電位分別為（30.2±1.1）、（32.2±0.8）mV。

2.1.3 TEM觀察 移液槍吸取少量AP@TPP-PEG- PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips溶液，滴加在200目銅網(wǎng)上，低溫吹干，TEM下找出各個樣品最適合觀察的質量濃度，最適質量濃度下樣品采用常規(guī)的磷鎢酸負染[13]，最后置TEM下觀察脂質體的微觀形態(tài)。電鏡結果如圖2所示，AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips均表現(xiàn)為規(guī)則球形結構。

圖1 AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips的粒徑分布和Zeta電位

圖2 AP@TPP-PEG-PE#Lips (a) 和AP@PEG-PE#Lips (b) 的電鏡圖

特征性分析結果表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips基本特性差異不顯著。

2.1.4 包封率及載藥量測定 吸取AP@TPP-PEG- PE#Lips溶液500 μL，15 000 r/min高速離心5 min，AP@TPP-PEG-PE#Lips截留在0.4 mL超濾離心管內（截留相對分子質量10 000，Millipore公司）。加入數(shù)倍甲醇，60 ℃水浴下溶解5 min破壞脂質體結構，促使AP從脂質體中解離出來，采用HPLC法[14]，具體方法步驟參考游利江等的[7]報道，測定脂質體包封的AP質量（內）；超濾膜外為游離AP，采用同樣的方法測定游離AP質量（外），計算脂質體的包封率為（81.4±2.2）%；冷凍干燥離心管內截留的AP@TPP-PEG-PE#Lips溶液，稱質量計為，計算AP@TPP-PEG-PE#Lips載藥量為（14.3±1.6）%。

包封率＝內/(外＋內)

載藥量＝內/

外為離心后游離AP質量，內為脂質體中AP質量，為AP@TPP-PEG-PE#Lips質量

2.2 AP@TPP-PEG-PE#Lips體外實驗

2.2.1 紅細胞溶血性考察 稱取AP、AP@PEG-PE# Lips和AP@TPP-PEG-PE#Lips適量，5 mL生理鹽水溶解后，再依次用生理鹽水半倍稀釋成AP質量濃度為5.00、2.50、1.25、0.62、0.31、0.16、0.08 mg/mL的系列溶液，移取以上配制好的AP和AP@TPP- PEG-PE#Lips系列溶液各200 μL至1.5 mL的潔凈Eppendorf（EP）管中，陽性對照EP管中只加200 μL蒸餾水，陰性對照EP管中只加200 μL生理鹽水，紅細胞溶血實驗具體操作步驟參考文獻報道方法[15]。采用酶標儀測定吸光度（），紫外吸收波長為540 nm。結果如表1所示，AP@TPP-PEG-PE# Lips和AP@PEG-PE#Lips的溶血率都非常小，基本上保持在5%以下，由此表明，TPP-PEG-PE#Lips具有較好的血液相容性。

溶血率＝(樣品―陰性對照)/(陽性對照―陰性對照)

表1 不同AP質量濃度的AP@TPP-PEG-PE#Lips對紅細胞溶血率的影響 (,n = 3)

2.2.2 穩(wěn)定性考察 將AP@TPP-PEG-PE#Lips放置在4 ℃冰箱中保存56 d，每隔7 d檢測該脂質體的粒徑和Zeta電位，結果見表2，結果表明，AP@ TPP-PEG-PE#Lips的粒徑和Zeta電位在冷藏期間基本上變化不大，聚合物分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）也基本保持在0.3以下，相對較小。該結果表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips在4 ℃存儲期間具有較好的穩(wěn)定性。

稱取AP@TPP-PEG-PE#Lips約1 mg，加入2 mL胎牛血清培養(yǎng)基（10%）在旋渦混合器上振蕩2 min使藥物完全溶解，加塞封口，于（37±1）℃的恒溫水浴鍋中共同孵育0、4、8、12、16、18、24 h后，按照上述方法處理樣品和測定樣品，檢測該脂質體的粒徑和Zeta電位，結果見表3。結果顯示，AP@TPP-PEG-PE#Lips在血清中粒徑和電位基本同最初狀態(tài)保持一致，檢測時由于存在血清蛋白的干擾，故試驗結果出現(xiàn)了少量的偏差。

表2 AP@TPP-PEG-PE#Lips在4 ℃下保存時穩(wěn)定性考察 (,n = 3)

表3 AP@TPP-PEG-PE#Lips在10%胎牛血清中的穩(wěn)定性考察 (,n = 3)

2.3 AP@TPP-PEG-PE#Lips的體外釋放研究[16]

取AP 0.3 mg、AP@PEG-PE#Lips（含AP 0.3 mg）和AP@TPP-PEG-PE#Lips（含AP 0.3 mg）分別置于Spectrumlabs透析袋（截留相對分子質量為20 000）中，預定時間點1、2、6、9、12、15、18、21、24、36、48、72 h采集樣本，紫外分光度光度計測定AP質量濃度，檢測波長540 nm，計算AP在膠束中的累積釋放率。結果如圖3所示，游離AP呈快速釋放趨勢，20 h其累積釋放率就高達82%，而AP@ PEG-PE#Lips和AP@TPP-PEG-PE#Lips均呈緩釋態(tài)勢，75 h累積釋放率才達到85%?？傊?，三者總體比較，AP@TPP-PEG-PE#Lips釋放藥物最慢，具有較好的緩釋性能。

圖3 AP@TPP-PEG-PE#Lips的體外釋放對比研究

2.4 細胞攝取實驗

2.4.1 細胞攝取量考察 將胃癌SGC7901細胞接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，再將制備好的DID@ PEG-PE#Lips和DID@TPP-PEG-PE#Lips（制備方法同AP@TPP-PEG-PE#Lips）加入細胞液中，使得細胞培養(yǎng)液中DID質量濃度為10 ng/mL，共同孵育1、2、3、4 h后，收集10 000個胃癌細胞，流式細胞儀檢測熒光強度，觀察DID@PEG-PE#Lips和DID@TPP-PEG-PE#Lips是否有細胞毒性。首先，尋找最適質量濃度。然后，在最適質量濃度下檢測樣品熒光強度，計算細胞攝入率（uptake rate）[17]。結果如表4和圖4所示，游離熒光染料DID對細胞攝取率沒有影響；DID@PEG-PE#Lips、DID@TPP- PEG-PE#Lips隨著時間的延長，細胞攝取率也相應增多，具有很好的時間相關性。孵育3 h時，兩者的細胞攝取量基本達到平衡狀態(tài)，且DID@TPP- PEG-PE#Lips細胞攝取率明顯高于DID@PEG-PE# Lips（＜0.01）。該結果表明，TPP陽離子能促進藥物的細胞攝取。

表4 不同質量濃度AP@TPP-PEG-PE#Lips對細胞攝取率的影響 (, n = 3)

A-不同時間點細胞攝取率 B-3 h細胞攝取的流式細胞圖 與DiD@PEG-PE#Lips比較：*P＜0.05 **P＜0.01

細胞攝取率＝實驗組藥物攝取量/對照組攝取量

2.4.2 細胞攝取方式考察 將胃癌SGC7901細胞接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液后，然再分別加入1 mL不同質量濃度的抑制劑：150 mg/mL蔗糖（網(wǎng)格蛋白抑制劑）、5 μg/mL環(huán)糊精（小窩蛋白介導抑制劑）、50 mmol/L 2--去氧葡萄糖（2--deoxyglucose，能量抑制劑）、50 μg/mL秋水仙堿（colchicine，微管形成抑制劑，巨胞飲抑制），以不做抑制劑處理的細胞作為對照。流式細胞儀進行檢測各組熒光強度分析[18]。結果如圖5所示，2--去氧葡萄糖和秋水仙堿處理組與對照組比較，DID@TPP-PEG-PE#Lips的細胞攝取率明顯減少，由此表明，該脂質體的細胞攝取方式屬于能量依賴過程，以細胞巨胞飲為主。

圖5 胃癌SGC7901細胞對DID@TPP-PEG-PE#Lips的細胞攝取方式

2.5 線粒體靶向研究

胃癌SGC7901細胞的前期處理過程同上，采用DID@TPP-PEG-PE#Lips和DID@PEG-PE#Lips與胃癌細胞共同孵育1、3 h后，將細胞取出，以50 nmol/L濃度MitoTracker?Green染線粒體（綠色）5 min，1 mg/mL Hoechst 33342染細胞核（藍色）5 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察脂質體進入細胞后的胞內分布。結果見圖6-A所示，綠色熒光的線粒體與紅色熒光的脂質體重合后顯示為黃色，DID@TPP-PEG-PE#Lips的黃色深度明顯高于DID@PEG-PE#Lips，且具有較好的時間相關性，在3 h時黃色最為明顯。定量結果見圖6-B，結果顯示，DID@TPP-PEG-PE#Lips的泊桑分布值明顯高于DID@PEG-PE#Lips，2組比較均具有極顯著性差異（＜0.01），由此可見，TPP陽離子能誘導脂質體靶向聚集在線粒體周圍，具有很好的線粒體靶向性。

2.6 促腫瘤細胞凋亡作用

2.6.1 細胞培養(yǎng) 胃癌SGC7901細胞接種于24孔培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

2.6.2 鋪板密度測定 鋪板前使用0.05%胰蛋白酶（含0.03% EDTA）消化，制成1 mL細胞懸液，取10 μL細胞懸液放于細胞計數(shù)板，在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)，計算鋪板密度（鋪板密度＝細胞數(shù)目/10 μL）。

2.6.3 細胞存活率測定 待胃癌SGC7901細胞長至約80%時，加入含有不同質量濃度藥物的1640培養(yǎng)基。藥物組設定有：AP、AP@PEG-PE#Lips組、AP@TPP-PEG-PE#Lips組，將其給藥質量濃度設定為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL，紫外分光光度計570 nm波長下檢測各組的值，對照只加PBS，按公式計算細胞存活率（細胞存活率＝加藥/對照），然后再計算各組的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）[19]。結果如圖7所示，給藥后腫瘤細胞的生長得到了明顯抑制，尤其是AP@TPP-PEG-PE#Lips，該藥對胃癌SGC7901細胞有時間、質量濃度依賴性生長抑制效果，隨著作用時間和藥物質量濃度的增加，AP@ TPP-PEG-PE# Lips對胃癌細胞的生長抑制率明顯升高，在高質量濃度下、48 h時的抗腫瘤效果最為顯著，IC50明顯低于AP@PEG-PE#Lips和AP原料藥，該實驗結果表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips能明顯增強藥物抑制腫瘤細胞生長效果（表5）。

與DiD@PEG-PE#Lips比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖7 AP、AP@PEG-PE#Lips和AP@TPP-PEG- PE#Lips與胃癌細胞孵育24 h (a)、48 h (b) 后細胞存活率

表5 AP、AP@PEG-PE和AP@TPP-PEG-PE脂質體細胞存活率的IC50 (, n = 3)

2.6.4 胃黏膜上皮GES-1細胞的細胞毒性 胃黏膜上皮GES-1細胞的處理過程同胃癌SGC7901細胞，然后給予以下藥物：AP@TPP-PEG-PE#Lips、AP@ PEG-PE#Lips，給藥質量濃度分別設定為2、4、8、16 μg/mL，空白對照組為未加藥，共同孵育48 h后，添加MTT和二甲基亞砜，參照以上的方法計算各組的細胞存活率，與空白對照組進行比較，其中AP由于具有水不溶性的特點，先將其溶解到DMSO中，配制成母液，再將其配制成16 μg/mL，其中DMSO終濃度為0.2%。結果如表6所示，不同質量濃度下，AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@ PEG-PE# Lips的細胞存活率差異不大，其中最高質量濃度16 μg/mL時AP@TPP-PEG-PE#Lips的細胞存活率仍然高達（93.6±1.7）%，AP@PEG-PE#Lips為 （95.4±2.2）%，由此表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips對正常胃黏膜上皮GES-1細胞毒性比較小，具有較好的生物相容性。

表6 AP、AP@PEG-PE#Lips和AP@TPP-PEG-PE#Lips對胃黏膜上皮GES-1細胞毒性的影響(, n = 3)

2.6.5 Hoechst 33258染色 取適量對數(shù)生長期的胃癌SGC7901細胞，培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)皿中，待細胞生長至約80%時，加入藥物組進行處理，具體分組同“2.6.4”項，Hoechst染色方法參考官娟等報道[20]，采用5% Hoechst 33258對細胞進行染色，通過統(tǒng)計軟件計算Hoechst染色率，即活細胞的比率。實驗結果見圖8，與對照組相比，所有給藥組的胃癌細胞均出現(xiàn)了形態(tài)變化現(xiàn)象，尤其是AP@TPP- PEG-PE#Lips處理組，該組的細胞核出現(xiàn)了顏色變暗、有些出現(xiàn)了碎塊狀致密濃染，Hoechst染色率最高，該結果提示，AP@TPP-PEG-PE#Lips組具有很好的抑制腫瘤細胞生長效果。

**P＜0.01

2.6.6 活性氧水平 取適量對數(shù)生長期的胃癌SGC7901細胞，細胞處理和給藥同“2.6.5”項，藥物與腫瘤細胞孵育48 h后，收集細胞，加入10 μmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針作用30 min，然后以PBS洗滌2～4次，除去細胞表面殘留的DCFH-DA，DCFH-DA正常情況下無熒光，進入細胞內后分解為DCFH，當細胞內的活性氧升高時，DCFH與活性氧反應生成帶熒光的二氨基熒光素（DCF），可以采用流式細胞技術檢測DCF熒光的強度，從而可以檢測細胞內活性氧水平。

結果見表7所示，AP@TPP-PEG-PE#Lips組的DCF熒光強度最高，明顯高于其余3組，具有顯著性差異（＜0.01），由此表明，AP@TPP-PEG-PE# Lips組可以明顯增加腫瘤細胞內活性氧水平，激活線粒體途徑誘導Caspase家族依賴的細胞凋亡，故具有很好的抑制腫瘤細胞生長效果。

2.6.7 Caspase-3活性 胃癌SGC7901細胞處理和給藥同“2.6.5”項，收集細胞，棄上清培養(yǎng)液，再采用PBS漂洗干凈，具體步驟參考Caspase-3活性檢測試劑盒。采用酶聯(lián)免疫檢測儀，設置波長為405 nm，測定該波長下的值。結果見表7所示，與對照組比較，給藥組的Caspase-3活性升高，其中，AP@TPP- PEG-PE#Lips組的Caspase-3活性最高，驗證了TPP-PEG-PE#Lips將較多的AP遞送到線粒體部位，激活Caspase家族依賴細胞凋亡，故細胞液中釋放的Caspase-3顯著增加。

2.6.8 線粒體膜電位 胃癌SGC7901的孵育及各組給藥處理同“2.6.5”項方法，給藥完成后收集腫瘤細胞，采用常用的JC-1（10 μg/mL）熒光探針檢測線粒體膜電位[21]，以流式細胞儀檢測熒光進行分析[22]。結果見表7，以對照組紅/綠熒光強度比值為基準，給藥組的該組比值與對照組進行比較，AP@ TPP-PEG-PE#Lips組的熒光比值最小，故促腫瘤細胞凋亡效果最優(yōu)。

表7 AP、AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips促腫瘤細胞凋亡的比較(, n = 3)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與AP組比較：#＜0.05##＜0.01；與AP@PEG-PE#Lips組比較：▲▲＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01AP group;▲▲< 0.01AP@PEG-PE#Lips group

2.6.9 Bax、Bcl-2蛋白表達 胃癌SGC7901的孵育及各組給藥處理同“2.6.5”項，對照組為含10%胎牛血清培養(yǎng)基取代藥物。采用Western blotting方法檢測[23]。以β-actin作內參，用Image J圖像分析軟件計算光密度。結果如圖9所示，與對照組比較，給藥組均可明顯降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達，提高促凋亡蛋白Bax表達；其中，AP@TPP-PEG-PE#Lips組調節(jié)凋亡相關蛋白的表達效果最明顯，與另外2個給藥組比較均存在顯著性差異，考慮到Bax和Bcl-2是線粒體凋亡途徑的主要相關蛋白，據(jù)此推測，TPP-PEG-PE#Lips有助于將大量藥物靶向聚集再線粒體部位，啟動細胞凋亡通路，從而，導致了相應凋亡蛋白出現(xiàn)了明顯的改變。

2.7 AP@TPP-PEG-PE#Lips作用胃癌模型小鼠的效果

在確認AP@TPP-PEG-PE#Lips體外對胃癌細胞具有促細胞凋亡后，進一步驗證AP@TPP-PEG- PE#Lips在胃癌皮下瘤BALB/C小鼠體內生物分布情況。選取60只4～5周齡的Balb/c裸鼠，將其置于SPF級動物房飼養(yǎng)，sc約0.1 mL 2×106/mL MKN45細胞懸浮液于裸鼠左側腹股溝處，待皮下瘤長至100 mm3左右。按照隨機分組原則，將胃癌荷瘤小鼠隨機分成4組，對照（生理鹽水）組、AP組（16 mg/kg）、AP@PEG-PE#Lips組（16 mg/kg）和AP@TPP-PEG-PE#Lips組（16 mg/kg），每組15只，分別在第0、4、8天向荷瘤小鼠尾部給予藥物。給藥后每天稱量小鼠體質量，測量小鼠皮下瘤瘤徑，皮下瘤體積計算公式：體積＝1/2×長度×寬度2；相對腫瘤體積＝第天腫瘤體積（V）－第0天腫瘤體積（0）。給藥30 d后，脊椎脫臼法處死小鼠，稱量皮下瘤質量。結果如圖10-a、c、d所示，對照組和AP組小鼠，皮下腫瘤增長較快；AP@TPP-PEG- PE#Lips組和陽性對照組能很好地抑制腫瘤生長；AP@ PEG-PE#Lips組緩慢抑制腫瘤生長。如圖10-b所示，4組小鼠體質量差異不顯著。結果表明AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE# Lips對胃癌腫瘤有顯著效果，且無明顯毒性。

　*P＜0.05 **P＜0.01

2.8 AP@TPP-PEG-PE#Lips在胃癌皮下瘤模型小鼠中的體內安全性評估

上述抑瘤實驗完成后，收集各組小鼠的脾臟、心臟、腎臟、肝臟和肺臟等主要器官以及皮下瘤，將其完全浸入至4%甲醛固定24 h，制作石蠟切片，進行HE染色[23]。結果如圖11所示，給藥后對照組、AP組（16 mg/kg）、AP@PEG-PE#Lips組（16 mg/kg）和AP@TPP-PEG-PE#Lips組（16 mg/kg）對胃癌皮下瘤小鼠主要器官均無顯著損傷。這些結果進一步說明AP@TPP-PEG-PE#Lips在哺乳動物體內應用時安全且毒性小。

2.9 AP@TPP-PEG-PE#Lips在胃癌皮下瘤模型小鼠中的作用機制研究

2.9.1 活性氧水平 收集各組小鼠的皮下瘤，胰酶消化成懸浮細胞后，按照“2.6.6”項中具體操作方式，檢測細胞內活性氧水平。結果如表8所示，AP@ TPP-PEG-PE#Lips組的DCF熒光強度明顯高于其他組，具有顯著性差異（＜0.01）。由此表明，AP@ TPP-PEG-PE#Lips組在體內也可以明顯增加腫瘤細胞內活性氧水平，抑制腫瘤生長。

a-皮下瘤的大體圖片 b-小鼠體質量曲線 c-皮下瘤體積生長曲線 d-皮下瘤質量

圖11 AP@TPP-PEG-PE#Lips在胃癌皮下瘤模型中的體內細胞毒性評估

表8 AP、AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips促胃癌皮下瘤細胞凋亡的比較(, n = 3)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與AP組比較：#＜0.05##＜0.01；與AP@PEG-PE#Lips組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01AP group;▲< 0.05▲▲< 0.01AP@PEG-PE#Lips group

2.9.2 Caspase-3活性 收集各組小鼠的皮下瘤，胰酶消化成懸浮細胞后，按照“2.6.7”項中具體操作方式，檢測細胞內Caspase-3活性。結果見表8所示，AP@TPP-PEG-PE#Lips組的的Caspase-3活性明顯高于其他組，具有顯著性差異（＜0.05、0.01）。這個結果進一步說明，TPP-PEG-PE#Lips將較多的AP遞送到線粒體部位，激活Caspase家族依賴細胞凋亡，故細胞液中釋放的Caspase-3顯著增加。

2.9.3 線粒體膜電位 收集各組小鼠的皮下瘤，胰酶消化成懸浮細胞后，按照“2.6.8”項中具體操作方式，檢測線粒體膜電位。結果見表8，以對照組紅/綠熒光強度比值為基準，與對照組進行比較，AP@TPP-PEG-PE#Lips組的熒光比值最小，故促腫瘤細胞凋亡效果最優(yōu)。

3 討論

胃癌作為臨床上高發(fā)的一種惡性腫瘤，對其治療手段目前主要以手術、化療和放療為主?；熀头暖熤委熜Ч睿皇中g對患者身體損傷較大，且術后并發(fā)癥多發(fā)，這些都是胃癌治療急需解決的難 題[24-26]。AP根源于中醫(yī)“扶正祛邪”科學理念，對惡性腫瘤細胞具有很好的殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，AP通過啟動線粒體凋亡通路，顯著抑制胃癌細胞的生長[27-29]。因此，可以構建一種新型靶向給藥系統(tǒng)，將AP精確遞送到腫瘤部位中細胞線粒體內。這對于提高該藥物的抗腫瘤效果具有重要意義，同時也為如何治療胃癌等頑固性腫瘤提供了新的研究思路。

增強藥物的療效，改善藥物的成藥性一直是制劑學研究的熱點。本研究以AP為研究對象，針對該藥存在的水難溶性問題，采用脂質體藥物載體進行包裹，提高AP的溶解性和抗腫瘤活性。針對該藥能上調胞內活性氧水平促使線粒體膜電位崩潰，釋放大量的Caspase-3進入細胞液中，迅速啟動線粒體凋亡通路，促發(fā)腫瘤細胞凋亡。故本研究采用具有線粒體靶向功能的TPP陽離子，介導脂質體藥物載體進入線粒體，制備了AP@TPP-PEG-PE# Lips。AP@TPP-PEG-PE#Lips粒徑為（23.8±1.7）nm，Zeta電位為（30.2±1.1）mV，在電鏡下表現(xiàn)為明顯核殼球狀結構，穩(wěn)定性良好，溶血率微乎其微，體外釋放具有很好的緩釋性能，有助于提高藥物在體內的存留時間。

細胞攝取試驗結果表明，TPP-PEG-PE#Lips可以明顯促進藥物的細胞攝取，且具有較好的時間依耐性，一方面由于脂質體的磷脂與細胞膜的磷脂雙分子層能很好的融合，有助于細胞膜的攝取脂質體；另外一方面是由于TPP-PEG-PE#Lips的正電荷性，可以與帶副電荷的細胞膜相互吸引，借助于正負電荷的吸引，促進脂質體的跨膜轉運；在細胞攝取方式研究方面，秋水仙堿能夠通過抑制微管形成從而抑制巨胞飲途徑，2--去氧葡萄糖是細胞無法利用的碳源，50 mmol/L時可阻斷糖酵解，與對照組比較，DID@TPP-PEG-PE#Lips的細胞攝取率明顯減少，由此表明，該脂質體的細胞攝取方式屬于能量依賴過程，以細胞巨胞飲為主；藥物進入細胞后，由于TPP陽離子的正電荷，被帶負電荷線粒體膜的吸引，故DID@TPP-PEG-PE#Lips可借助于正負電荷吸引效應，聚集在腫瘤細胞線粒體周圍，從而實現(xiàn)了藥物的線粒體傳輸。

目前已經(jīng)文獻證實細胞膜帶30～60 mV負電荷，線粒體內膜帶150～180 mV負電荷，兩者負電荷的疊加作用，可促使TPP陽離子聚集于線粒體的能力提高100～500倍，同時還能克服高黏度細胞液的阻礙，很大程度上提高腫瘤藥物進入線粒體的效率，從而增強了藥物抗腫瘤效果[10-11]。為了驗證此推測，本研究進行了AP@TPP-PEG-PE#Lips促腫瘤細胞凋亡的藥效試驗，與AP和AP@PEG- PE#Lips比較，細胞毒試驗顯示AP@TPP-PEG-PE# Lips能夠明顯抑制胃癌細胞的生長，且對正常的毒性較小，具有良好的生物相容性，正好驗證了中醫(yī)藥“扶正祛邪，祛邪不傷正”的優(yōu)越性；Hoechst 33258染色試驗很直觀的揭示了AP@TPP-PEG-PE# Lips誘導腫瘤細胞凋亡的效果良好，明顯高于其余2個給藥組；線粒體凋亡機制試驗結果顯示，AP@TPP-PEG- PE#Lips可以顯著升高細胞內ROS水平和Caspase-3活性，降低線粒體膜電位，明顯降低抗凋亡蛋白BCl-2表達，提高促凋亡蛋白Bax表達。同時，還進行了胃癌皮下瘤實驗，結果發(fā)現(xiàn)AP@ TPP-PEG- PE#Lips能顯著抑制胃癌腫瘤體積，而不影響小鼠體質量；進一步分析其機制，發(fā)現(xiàn)與體外實驗結果類似，可以升高細胞內活性氧水平和Caspase-3活性，降低線粒體膜電位等。

綜上所述，AP@TPP-PEG-PE#Lips的粒徑較小，穩(wěn)定性良好，具有良好的生物相容性和線粒體靶向性，能顯著增強藥物促腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤生長作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of andrographolide TPP-PEG-PE liposomes with mitochondrial targeting function and its mechanism in gastric cancer model mice

AN Li-li1, SUN He-jun1, KONG Yong-hong1, WANG Xin-ming1, ZHAO Cheng-long2, 3

1. Department of Pharmacy, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China 2. Department of Gastroenterology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 454002, China 3. Henan Academy of Chinese Medicine, Zhengzhou 450004, China

To prepare andrographolide (AP) triphenyl phosphate (TPP)-polyethylene glycol (PEG)-polyethylene (PE) liposomes (AP@TPP-PEG-PE#Lips), and study itsrelease, hemolysis, mitochondrial targeting, the mechanism of promoting gastric cancer cell apoptosis and acting on gastric cancer model mice.The membrane hydration method was used to prepare AP@TPP-PEG-PE#Lips; The particle size, electric potential, micro-electron microscopic morphology, stability, hemolysis andrelease of the liposomes were detected; Flow cytometry was used to measure the uptake of gastric cancer cells to liposomes, and laser confocal microscopy to study its mitochondrial targeting; AP@TPP-PEG-PE#Lips in gastric cancer cells and effects of apoptosis and gastric cancer model mice were evaluated.The particle size of AP@TPP-PEG-PE#Lips is (23.8 ± 1.7) nm, the Zeta potential is (30.2 ± 1.1) mV, the distribution is relatively uniform, and the regular spherical structure;tests showed that AP@TPP-PEG- PE#Lips had low hemolysis rate, sustained release performance and good blood compatibility; Fluorescence test results showed that TPP-PEG-PE#Lips can promote the cellular uptake of drugs; AP@TPP-PEG-PE#Lips act on gastric cancer cells and gastric cancer model mice, the results showed that AP@TPP-PEG-PE#Lips can significantly reduce the mitochondrial membrane potential of gastric cancer cells, increase intracellular reactive oxygen species (ROS) content, and promote cysteine The release of Caspase-3 increased the pro-apoptotic protein B lymphocyte tumor-2 (Bcl-2) and decreased the expression of anti-apoptotic BCL2-Associated X (Bax) protein (< 0.05).AP@TPP-PEG-PE#Lips can effectively deliver the drug to the mitochondria and enhance the drug’s effect of promoting tumor cell apoptosis.

mitochondrial targeting; andrographolide; TPP-PEG-PE; liposome; cell uptake; gastric cancer;release; hemolytic; apoptosis; membrane hydration method; reactive oxygen species; Caspase-3; Bcl-2; Bax

R283.6

A

0253 - 2670(2021)07 - 1945 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.011

2020-09-22

河南省衛(wèi)生健康委基金項目（201702161）

安麗麗，主管藥師，研究方向腫瘤藥物的靶向設計。E-mail: 1148118202@qq.com

趙成龍，博士，研究方向為納米藥物。E-mail: zhaocl@hotmail.com

#共同第一作者：孫賀軍，主管藥師，研究方向腫瘤藥物的靶向設計。E-mail: 1148118202@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]