馬曉艷，王 文，蘇曉慧，薛 文，陳衛(wèi)東，翟少華，陳榮貴，王永生，夏 俊，秦 菊，努爾麥麥提·阿穆提

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；3.伊犁州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆伊寧 835000；4.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830011）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病（lumpy skin disease，LSD）又稱牛疙瘩皮膚病、牛結(jié)節(jié)疹，是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的牛的一種急性、亞急性或慢性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)在《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》中將其列為一類傳染病[1]?；疾∨Ｊ窃摬〉闹饕獋魅驹矗《敬嬖谟诓∨５钠つw結(jié)節(jié)、肌肉、血液、內(nèi)臟、唾液、鼻腔分泌物及精液中。病?；謴?fù)后常帶毒3 周以上。LSDV 還可以通過蚊子、蒼蠅等節(jié)肢動(dòng)物機(jī)械性傳播，也可通過飲水、飼料或直接接觸而傳播，在蚊蟲活躍時(shí)期由其引起的發(fā)病概率會(huì)明顯增高[2-3]。

2019 年8 月，新疆伊犁州察布查爾縣、霍城縣、伊寧市陸續(xù)有獸醫(yī)報(bào)告發(fā)現(xiàn)，多個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的牛皮膚、乳頭、睪丸、鼻腔、口腔等部位長(zhǎng)有大小不等的疙瘩。臨床排查發(fā)現(xiàn)，累計(jì)3 個(gè)縣（市）的17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)生上述情況。初步臨床診斷后，采集特征性病變的牛皮膚結(jié)節(jié)及病死牛組織臟器開展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并將樣品及時(shí)送至中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心診斷，最終確定病原為L(zhǎng)SDV。截至8 月13 日，伊犁州畜牧獸醫(yī)部門累計(jì)排查活牛67.14 萬(wàn)頭。共有504 頭牛相繼發(fā)病，并伴有持續(xù)高燒，其中死亡1 頭，發(fā)病率為17.83%（1/2 826），病死率為0.20%（1/504）。發(fā)病牛以母牛居多，不同年齡的牛均有發(fā)病，懷孕病牛未見流產(chǎn)情況。

這是我國(guó)首起LSD 疫情，本文介紹了該疫情的診斷及處置情況，以期為L(zhǎng)SD 防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

高速八維旋轉(zhuǎn)組織研磨儀，購(gòu)自德國(guó)Bertin公司；核酸提取儀NP968，購(gòu)自西安天隆有限責(zé)任公司；熒光PCR 儀QuantStudio 5，購(gòu)自ABI 公司；離心機(jī)，購(gòu)自Sigma 公司；生物安全柜，購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；冰凍切片機(jī)，購(gòu)自萊卡公司；超薄切片機(jī)，購(gòu)自LKB 公司。

1.2 主要試劑

LSDV 特異性引物、熒光標(biāo)記探針、陽(yáng)性/陰性對(duì)照，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；DNA 病毒熒光PCR 反應(yīng)液（生產(chǎn)批號(hào)YDNA20190401），購(gòu)自哈爾濱世紀(jì)元亨公司；羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA 試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)E83），購(gòu)自法國(guó)IDVET 公司。

1.3 樣品采集

采集3 頭發(fā)病牛樣品共58 份，包括皮膚、睪丸、乳頭等部位結(jié)節(jié)和病死牛肺臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等臟器的12 份病原樣品以及46 份血清樣品。對(duì)采集的樣品開展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，同時(shí)送至國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心檢測(cè)。

此外，LSD 疫情解封時(shí)，按照30%的比例全覆蓋抽樣，采集牛全血樣本833 份及蚊蟲樣品5 袋。其中察布查爾縣共有15 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)和1 個(gè)牧業(yè)公司，陽(yáng)性同群牛2 635 頭，另采集其中2 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的蚊蟲5 袋；伊寧市3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，陽(yáng)性同群牛144 頭；霍城縣2 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，陽(yáng)性同群牛47 頭。3 個(gè)疫區(qū)共采樣743 份抗凝血；同時(shí)3 個(gè)受威脅區(qū)的規(guī)模場(chǎng)及散養(yǎng)戶進(jìn)行同樣數(shù)量的抽樣監(jiān)測(cè)，昭蘇縣采集1 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)4 個(gè)村，鞏留縣1 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)5 個(gè)村，特克斯縣采集2個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，3 個(gè)受威脅區(qū)各采集30 份抗凝血共90 份。

1.4 組織病理學(xué)檢查

切取一塊2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm 大小，并經(jīng)病原學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，以10%甲醛和95%乙醇固定，經(jīng)各種濃度乙醇脫水2 h；二甲苯透明處理，將透明好的組織塊放入石蠟中包埋；修整蠟塊后切片，將切好的組織蠟片用眼科鑷平鋪在40～45 ℃的水面上；用載玻片撈取后，傾去余水，再置入60～65 ℃恒溫箱內(nèi)烤片，最后進(jìn)行HE 染色和封片。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)

通過檢測(cè)牛血清中LSD 病毒抗體來(lái)判定是否感染。根據(jù)羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA 試劑盒的規(guī)程進(jìn)行操作，檢測(cè)牛血清中LSD 病毒抗體，共檢測(cè)牛血清46 份。

1.6 病原學(xué)診斷

將采集的發(fā)病牛皮膚以及睪丸、乳頭、鼻腔等部位結(jié)節(jié)以及病死牛肺臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等臟器的12 份樣品，在生物安全柜中進(jìn)行處理、研磨；用磁珠法在核酸提取儀中提取病毒DNA，熒光PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。具體方法：在生物安全柜中處理、研磨后，將研磨液離心吸取上清，提取DNA，使用中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供的LSDV 熒光探針、引物，以及商品化的DNA 病毒熒光PCR 反應(yīng)液，根據(jù)聶福平等[4]建立的LSDVTaqMan-MGB 熒光定量PCR 方法對(duì)提取的DNA開展熒光PCR 擴(kuò)增。

LSD 疫情解封時(shí)，對(duì)采集的833 份牛全血樣本及蚊蟲樣品同樣按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

在伊犁州察布查爾縣、霍城縣的疫點(diǎn)可觀察到：患病牛精神倦怠、消瘦、體溫升高；皮膚出現(xiàn)非常堅(jiān)硬的丘疹或圓形凸起的結(jié)節(jié)，用手觸碰病牛結(jié)節(jié)，病牛疼痛難忍；除全身皮膚結(jié)節(jié)外，在母牛會(huì)陰、乳頭部位，公牛睪丸部位，鼻腔內(nèi)部、嘴唇周邊都能看到大小不等的結(jié)節(jié)（圖1～3）。結(jié)節(jié)直徑約1～7 cm，厚度約1～3 cm。

2.2 剖檢病理變化

圖1 牛腹部?jī)蓚?cè)皮膚表面結(jié)節(jié)[5]

圖2 牛大腿外側(cè)皮膚結(jié)節(jié)[5]

圖3 牛乳房表面結(jié)節(jié)

剖檢病死牛發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)疙瘩處的臟器皮內(nèi)腫脹，心肌條狀、點(diǎn)狀出血，肝臟、脾臟出血，膽囊脹大充盈、出血，脾臟質(zhì)地變硬，真胃黏膜出血，小腸、大腸黏膜點(diǎn)狀出血，腸系膜淋巴結(jié)出血，頜下淋巴結(jié)腫大，肺臟出血。觀察現(xiàn)場(chǎng)采集的發(fā)病牛皮膚結(jié)節(jié)樣品發(fā)現(xiàn)，皮膚腫脹部位有明顯凸起，皮膚結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)出血，并有膠凍樣病變（圖4～5）。通過臨床癥狀和剖檢病理變化，初步判定為疑似LSD。

圖4 牛結(jié)節(jié)性皮膚塊外側(cè)

圖5 牛結(jié)節(jié)性皮膚塊內(nèi)側(cè)

2.3 皮膚結(jié)節(jié)病理切片觀察

在顯微鏡下觀察皮膚結(jié)節(jié)病理切片發(fā)現(xiàn)，肌肉間結(jié)締組織出現(xiàn)增生性結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)可見成纖維細(xì)胞和膠原組織，結(jié)節(jié)周圍有結(jié)締組織包囊形成及結(jié)節(jié)周圍有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖6）。此外，還可觀察到表皮毛囊周圍組織間隙淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊腺體腫脹、空泡化，真皮層肌肉組織壞死，且壞死區(qū)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖7）。

2.4 血清學(xué)檢測(cè)

用羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA試劑盒，對(duì)46 份發(fā)病牛血清進(jìn)行LSDV 抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，16 份樣品LSDV 抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為34.78%。

圖6 病變組織病理橫切片

圖7 病變組織病理縱切片

2.5 病原學(xué)檢測(cè)

2.5.1 發(fā)病牛結(jié)節(jié)樣品熒光PCR 檢測(cè) 對(duì)采集的12 份病原樣品（皮膚、睪丸、鼻腔、乳頭結(jié)節(jié)以及剖檢病死牛的肺臟、淋巴結(jié)等臟器）進(jìn)行熒光PCR 擴(kuò)增。結(jié)果（圖8）顯示，所有樣品均為L(zhǎng)SDV 核酸陽(yáng)性。經(jīng)國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心確診，伊犁州察布查爾縣的部分牛感染LSDV。

圖8 發(fā)病牛樣品LSDV 熒光PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.5.2 解封后所采集樣品熒光PCR 檢測(cè) 參照二類動(dòng)物疫病防治技術(shù)規(guī)范要求，相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)疫區(qū)實(shí)施了為期42 d 的疫情封鎖。解封時(shí)，在伊寧縣、霍城縣、察布查爾縣選擇疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)的鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村，開展抽樣監(jiān)測(cè)，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。通過實(shí)地察看，按照30%的比例全覆蓋抽樣，采集牛抗凝血及疫點(diǎn)周邊活動(dòng)的蚊蟲樣品共833 份。對(duì)上述樣品開展LSDV 熒光PCR 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品檢測(cè)均呈陰性（圖9）。

圖9 解封樣品LSDV 熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

3 疫情處置

3.1 嚴(yán)格處置確診疫情，控制疫情擴(kuò)散

一是撲殺陽(yáng)性同群牛，限制同群牛移動(dòng)（出牧場(chǎng)或出戶），禁止疫情縣活牛調(diào)出，禁止發(fā)病區(qū)域牛進(jìn)出和流通，疫情發(fā)生前1 個(gè)月內(nèi)生產(chǎn)的牛皮需鞣制成皮革方可調(diào)出。二是對(duì)疫點(diǎn)、掩埋場(chǎng)點(diǎn)、運(yùn)輸車輛嚴(yán)格清洗消毒。每次裝運(yùn)前進(jìn)行消毒，運(yùn)后再次清洗消毒，用次氯酸鈉，按照由里向外、自上而下、從前到后的順序清除牛糞、飼料等污物，清洗后晾干，再噴霧消毒。三是定期開展流行病學(xué)調(diào)查，查明疫情來(lái)源和可能傳播去向，并對(duì)出現(xiàn)疑似疫情的周邊區(qū)域等相關(guān)場(chǎng)地進(jìn)行持續(xù)排查，及時(shí)消除疫情隱患?，F(xiàn)場(chǎng)查看養(yǎng)殖、防疫、無(wú)害化處理等相關(guān)記錄，持續(xù)監(jiān)測(cè)，形成流調(diào)報(bào)告，并提出相關(guān)防控指導(dǎo)意見和疫情處置措施。四是加強(qiáng)聯(lián)防聯(lián)控，重點(diǎn)排查與哈薩克斯坦交界的相關(guān)縣市，要求牛只遠(yuǎn)離邊界草場(chǎng)放牧，發(fā)現(xiàn)病畜及時(shí)上報(bào)、隔離、消毒，同時(shí)采取殺滅昆蟲等措施，防止疫情進(jìn)一步擴(kuò)散。五是積極宣傳。組織邊境縣各鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）落實(shí)好宣傳等工作，防止出現(xiàn)恐慌，影響社會(huì)穩(wěn)定。

3.2 用山羊痘疫苗緊急免疫

為杜絕疫情再次發(fā)生和蔓延，采用國(guó)家批準(zhǔn)的山羊痘疫苗（按山羊5 倍劑量）對(duì)病牛所在的縣及其相鄰縣（市）全部牛只開展免疫，免疫程序按照農(nóng)牧發(fā)〔2019〕26 號(hào)文件要求執(zhí)行。在政策允許的前提下，將免疫區(qū)域擴(kuò)大到與新疆相鄰省份，以確保不發(fā)生新的LSD 疫情。伊犁州3 個(gè)市、縣解除封鎖時(shí)，于9 月下旬采樣，采集牛樣品、環(huán)境蚊蟲，開展LSD 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)[4]，發(fā)現(xiàn)所有采集樣品包括蚊蟲全部為陰性（圖9）。后期還要做好LSD 專項(xiàng)監(jiān)測(cè)與排查工作（尤其在每年4—10 月），可通過血清學(xué)（ELISA）和病原學(xué)（PCR）檢測(cè)，重點(diǎn)對(duì)伊犁州及全疆其他縣市調(diào)入調(diào)出的牛群開展監(jiān)測(cè)，防止疫情再次發(fā)生。

4 討論

為及時(shí)查明此次疫情的感染源，通過察看臨床癥狀、剖檢病理變化以及結(jié)合發(fā)病時(shí)間（7 月底至8 月上旬蚊蟲肆虐期），初步判定該疫情為疑似LSD。隨后采集發(fā)病牛的鼻腔、乳頭等部位結(jié)節(jié)和發(fā)病牛血清，開展病原學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)。熒光PCR 檢測(cè)病原樣品發(fā)現(xiàn)LSDV 核酸陽(yáng)性；羊痘/牛結(jié)節(jié)性皮膚病雙抗原夾心ELISA 試劑盒檢測(cè)發(fā)病牛血清，發(fā)現(xiàn)LSDV 抗體陽(yáng)性。經(jīng)國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心檢測(cè)，送檢的疑似病料確診為L(zhǎng)SDV核酸陽(yáng)性，這是我國(guó)首次確診發(fā)現(xiàn)LSD 病例。

在LSD 流行的非洲等國(guó)家，該病的檢測(cè)技術(shù)主要有病原分離鑒定、常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)[6]。本文利用靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光PCR 方法開展LSDV 分子生物學(xué)檢測(cè)，利用雙抗原夾心ELISA 開展發(fā)病初期血清學(xué)檢測(cè)，結(jié)合臨床癥狀、病理變化等輔助手段對(duì)LSD 進(jìn)行快速診斷，并在疫情確診后對(duì)疫區(qū)實(shí)施了封鎖等一系列處置措施。在疫區(qū)解封后采集樣品開展檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有樣品均呈陰性，說明處置措施得當(dāng)、有力，有效遏制了該病的傳播，后期持續(xù)臨床監(jiān)測(cè)顯示也沒有新的疫情發(fā)生。此外，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定并印發(fā)了《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防控知識(shí)手冊(cè)》等文件，今后也須盡快制定其他LSD 相關(guān)國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，為檢測(cè)、防控、消除LSD 做好技術(shù)支撐。